论文部分内容阅读
目的研究干扰素-γ(IFN-γ)在体外对人黑色素瘤细胞系MUM-2B迁移、侵袭和血管生成拟态(VM)形成能力的影响,探讨其可能的分子机制。方法以人黑色素瘤细胞系MUM-2B作为研究对象,分3组进行体外培养:对照组在含有10%FBS的DMEM培养基中培养;实验组分别在含有10%FBS的DMEM培养基中加入10μg/L IFN-γ和100μg/L IFN-γ;第一部分:观察IFN-γ在体外对黑色素瘤细胞VM形成能力的影响1.利用划痕实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞迁移能力的影响;2.利用Transwell侵袭实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞侵袭能力的影响;3.利用三维培养实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞体外形成VM管道能力的影响。第二部分:探讨IFN-γ对黑色素瘤细胞VM影响的分子机制4.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞STAT1磷酸化的影响;5.利用RT-PCR检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关标记物VE-cadherin、Vimentin和E-cadherin在m RNA水平表达的影响;6.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关标记物VE-cadherin、Vimentin和E-cadherin在蛋白水平表达的影响;7.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关调节因子Twist1和Slug在蛋白水平表达的影响;8.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞VEGF在蛋白水平表达的影响;9.利用明胶酶谱实验检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞基质金属蛋白酶家族成员MMP-2和MMP-9活性的影响。结果1.划痕实验结果显示,IFN-γ处理组的细胞迁移距离均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组的细胞迁移距离低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);2.Transwell侵袭实验结果显示,IFN-γ处理组的穿膜细胞数均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组的穿膜细胞数低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);3.三维培养结果显示,24 h后,对照组细胞可形成平滑、完整的VM管道样结构;实验组细胞均不能形成VM管道样结构;4.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的p-STAT1表达水平均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的p-STAT1表达水平高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);5.RT-PCR结果显示,IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在m RNA水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在m RNA水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);IFN-γ处理组细胞的E-cadherin在水平的m RNA表达均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的E-cadherinm在水平的m RNA表达高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);6.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在蛋白水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在蛋白水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);IFN-γ处理组细胞的E-cadherin在蛋白水平的表达均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的E-cadherinm在蛋白水平的表达高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);7.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的EMT调控因子Twist1和Slug在蛋白水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的Twist1和Slug在蛋白水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);8.Western Blot结果显示,IFN-γ处理组组细胞的VEGF蛋白表达量均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VEGF蛋白表达量低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);9.明胶酶谱结果显示,IFN-γ处理组细胞MMP-2和MMP-9的活性均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞MMP-2和MMP-9的活性均低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);结论1.划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和三维培养实验结果显示,加入不同浓度的IFN-γ后,MUM-2B细胞的迁移距离缩短、细胞侵袭数量减少,体外管道形成能力减弱,提示IFN-γ可以在体外抑制黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和管道形成能力。2.RT-PCR和Western Blot结果显示,IFN-γ可促进MUM-2B细胞STAT1的磷酸化,抑制MUM-2B细胞间充质标记物VE-cadherin、Vimentin的表达,促进上皮标记物E-cadherin的表达,抑制EMT调控因子Twist1和Slug的表达,提示IFN-γ可通过激活STAT1信号通路而抑制EMT过程,进而抑制黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和VM的形成。3.Western Blot和明胶酶谱实验结果显示,IFN-γ可抑制MUM-2B细胞VEGF的表达,抑制MMP-2和MMP-9的活性,提示IFN-γ可通过抑制VEGF的表达而抑制黑色素瘤细胞VM的形成,也可通过抑制VEGF而抑制MMP-2和MMP-9的活性,使其不能为VM的形成提供的足够空间基础,从而抑制VM的形成。