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本文借助M&S营养液培养的方法,以模式植物拟南芥为试材,采用随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)标记技术、微卫星标记(Simple Sequence Repeats,SSR)技术,并结合幼苗的形态和生理指标,研究不同浓度镉(Cd)、铜(Cu)胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗基因组DNA损伤的影响。并在此基础上,比较、分析了不同测试指标对Cd、Cu胁迫响应的敏感性,进而筛选出对胁迫响应敏感的生物标记物。
主要结果如下:
1.不同浓度(0~5.0 mg·L-1)Cd处理24 d后,拟南芥幼苗叶片数与对照组相比没有变化;叶片鲜重略有变化,但与对照组相比差异不显著;而根长变化与对照组相比差异显著,且随Cd胁迫强度的增加明显降低。
2.不同浓度(0~5.0mg·L-1)Cd处理24 d后,拟南芥幼苗地上部叶绿素含量的变化与对照组相比差异均不显著;叶片可溶性蛋白含量随Cd浓度的增加变化明显,呈先升高后降低的趋势,0.125 mg·L-1 Cd处理下,叶片可溶性蛋白含量显著增加;3.0 mg·L-1 Cd处理下,可溶性蛋白显著低于对照组。
3.用12条寡核苷酸引物对拟南芥幼苗地上部分与根系基因组DNA进行PCR(polymerase chain reaction)扩增,发现处理组与对照组RAPD图谱之间存在明显差异,且与镉浓度之间存在剂量-效应关系。基因组模板的稳定性(Genomic Template Stability, GTS)随着Cd浓度的增加而降低。各处理组幼苗地上部分GTS分别为91.4%、88.6%和80%;相应根部GTS分别为71.4%、67.1%和60%。比照其他几个指标,拟南芥幼苗根部RAPD谱带变化的敏感性更为优异,具有较好的应用前景。
4.不同浓度Cd、Cu处理24 d后,拟南芥幼苗根系微卫星位点的稳定性发生了变化。通过克隆测序的方法,从9对引物中分别筛选出3对引物(Cd:NGA1107、NGA8、 NGA168; Cu: NGA151、NGA8、NGA168),其微卫星位点变化具有一定的规律性,可以作为土壤污染诊断的敏感生物标记物
5.试验结果显示,不同指标对Cd胁迫均具有响应,但响应的阈值及敏感度不同。将各指标联合使用可使土壤污染的生态毒理诊断更为全面有效。本研究为土壤Cd、Cu污染早期诊断敏感指标筛选及指标组合提供了实验依据,为土壤重金属污染早期诊断奠定了方法基础。