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卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV),即人疱疹病毒8型,是近年来于KS(卡波氏肉瘤)病损组织中发现的一种新型疱疹病毒。KSHV与卡波氏肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤及多发性卡斯特曼综合征的发生密切相关。KSHV的生活周期包括潜伏期感染与裂解期感染。潜伏期感染时病毒利用宿主细胞的复制机器进行复制,在裂解期感染中,病毒依赖其本身编码的多种复制蛋白进行复制。其中KSHV聚合酶(Polymerase)Pol-8与延续因子(ProcessivityFactor)PF-8协调作用在DNA合成的延伸反应中起作用。本论文对KSHVPF-8在裂解期复制中的功能、细胞内二聚化及与其它复制相关蛋白的相互作用方面开展了研究。
本论文第一章内容是文献综述。首先简要介绍了KSHV的发现与致病性、病毒粒子结构、病毒的生活周期,然后综述了病毒的裂解期复制蛋白及复制复合物的装配的研究进展,最后介绍了PCNA及疱疹病毒聚合酶延续因子的结构、功能及相互作用的蛋白。
第二章内容是KSHVPF-8在病毒裂解期复制中的功能研究。PF-8可通过固定Pol-8在引物模板上而使Pol-8持续合成全长基因组DNA。PF-8以二聚体形式存在于溶液中或结合在DNA上。体外实验证实PF-8的二聚化与其结合Pol-8及固定Pol-8在引物模板上等功能密切相关。PF-8可通过其C-末端的核定位信号及位于N端或C端的Pol-8结合结构域转运Pol-8入核。为进一步研究PF-8在病毒裂解期复制中的作用,我们使用细菌人工染色体系统(BAC36)构建了ORF59缺失的KSHV重组病毒细菌人工染色体质粒BACA59。将野生型BAC36及突变体BACA59DNA转染293T细胞并通过筛选获得稳定细胞系。比较野生型与突变体的表型发现,BACA59的DNA复制功能缺失,且可通过瞬时转染PF-8表达质粒而互补,但转染不能形成二聚体的PF-8截短体或能形成二聚体的PF-8截短体表达质粒后,病毒复制功能得不到互补。这些结果说明PF-8对病毒裂解期复制是必需的,PF-8的二聚化是病毒复制的前提条件,全长的PF-8对病毒DNA合成是必需的。
第三章内容是聚合酶延续因子PF-8在细胞内二聚化的研究。聚合酶延续因子PF-8对KSHV裂解期复制是必需的。PF-8可在溶液中形成二聚体并以二聚体的形式结合在DNA上。本研究中我们证实了PF-8在细胞内发生二聚化,PF-8的1-21位及277-304位氨基酸为PF-8在细胞内二聚化的必需结构域。同时发现PF-8在细胞质内二聚化后转运入核。并意外发现缺失了C-末端核定位信号(NLS)的二聚化的PF-8截短体能定位在细胞核,其入核的机制可能与PF-8截短体的二聚化有关。这些结果提示PF-8在细胞质二聚化可能是预复制复合物形成的第一个步骤。
第四章内容是聚合酶延续因子PF-8蛋白与K8α相互作用及K8α对ORF59启动子的转录抑制活性的研究。我们通过酵母双杂交检测了KSHV复制相关蛋白两两之间的相互作用,得到五组相互作用的蛋白,分别是PF-8与Pol-8,PF-8与PF-8,PF-8与HEL,K8α与PF-8,RTA与Pol-8。我们进一步通过GST-pulldown、co-IP及共定位实验证实了K8α与PF-8的相互作用。此外,我们发现K8α以剂量依赖的方式下调ORF59的启动子活性。K8α发挥转录抑制活性的关键部位为碱性区域(BR),作用于ORF59启动子的-109～-1位。K8α转录抑制的机制为非苏素化、非CBP依赖的方式。以上结果对理解KSHV复制复合物的装配及K8α的生物学功能有重要意义。