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前言 胃癌在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，目前主要的治疗手段包括外科手术和化疗。对于不可手术的患者，化疗能够延长生存期和提高生活质量。然而，进展期胃癌患者的预后仍然是很不理想的。此外，细胞毒化疗药物的副作用常常导致进展期胃癌患者生活质量下降。因此，为了提高临床治疗效果，需要更多有效的可耐受的治疗方案。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)广泛应用于包括胃癌在内的实体肿瘤的治疗。但胃癌患者对5-FU的敏感性非常有限。因此，有必要进一步研究5-FU作用的机制及如何提高5-FU的疗效。目前已经深入探讨了在肿瘤治疗方面如何提高肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡敏感性的方案，近期的研究显示EGFR/SRC/AKT信号通路与5-FU的敏感性有关，提示调节EGFR/SRC/AKT信号通路的蛋白可能对5-FU的敏感性有一定的影响。 Cbl作为E3泛素连接酶发挥作用，它的RING辛指节构募集E2连接酶，而它的Src同源区域识别被泛素化的靶蛋白。Cbl-b是Cbl家族成员之一，在造血细胞大量表达，研究显示Cbl-b能通过抑制细胞表面受体及其下游信号通路的激活而负性调节T细胞、B细胞和主细胞的活化以及白血病发生。Feng等的研究表明，PI3K的调节亚单位p85也是Cbl-b的作用底物，Cbl-b以蛋白酶解非依赖的方式负性调节p85。Cbl-b（-/-）cells存在AKT的高度活化及晚期T细胞的异常增殖。我们先前的研究表明，化疗药物如依托铂苷、表阿霉素、柔红霉素及三氧化二砷能上调白血病细胞Cbl-b的表达，Cbl-b通过抑制PI3K/AKT信号通路增加化疗敏感性。我们近期的研究结果进一步证实Cbl-b提高5-FU诱导胃腺癌多药耐药细胞SGC7901/ADR的化疗敏感性。尽管还没有直接的证据，这些资料表明Cbl-b可能通过EGFR/SRC/AKT信号通路参与调节胃癌细胞对5-FU的敏感性。因此，综合文献报道，我们提出如下推测:Cbl-b通过促进EGFR、SRC和AKT等的泛素化，下调EGFR、SRC和AKT等的活化，使增殖信号传导减弱，从而协同5-FU抑制胃癌细胞增殖，Cbl-b可能对抑制人类肿瘤细胞包括胃癌细胞的增殖，提高化疗敏感性起到关键的作用。 本研究以人胃癌细胞株MGC-803、BGC-823和SGC-7901为研究对象，进行如下研究:观察5-FU对3种胃癌细胞系的增殖抑制作用;研究5-FU作用胃癌MGC803细胞是否存在EGFR、SRC、AKT等蛋白表达的变化，以及是否存在Cbl-b蛋白表达的变化;探讨转染Cbl-bshRNA的胃癌MGC803细胞与转染vector的细胞相比较，对5-FU的敏感性是否存在差异;明确Cbl-b是否可以通过EGFR/SRC/AKT信号通路调控5-FU抑制胃癌细胞增殖。 材料和方法 1、细胞培养 2、Cbl-bshRNA稳定转染胃癌MGC803细胞系的建立 3、MTT检测增殖抑制 4、流式细胞仪检测细胞凋亡 5、免疫沉淀及免疫杂交检测蛋白表达 6、统计学处理:每次实验重复3次，数据以Mean±S.D.表示，采用SPSS13.0软件进行t检验。P＜0.05有统计学意义。 结果 一、5-FU对胃癌细胞增殖抑制和凋亡的影响 （一）5-FU作用胃癌MGC803细胞不同时间（24h、48h和72h）可抑制细胞增殖，不同剂量5-FU作用三种胃癌细胞系（MGC803、SGC7901和BGC823）48h可不同程度抑制细胞增殖，IC50值分别是2.0±0.9μg/mL、4.5±1.1μg/mL和1.3±0.8μg/mL，差异无统计学意义，P值均＞0.05。 （二）5-FU（2.0μg/mL）作用不同时间(24h，48h和72h)可诱导MGC803细胞不同程度的凋亡，5-FU(2.0μg/mL)作用三种胃癌细胞系(MGC803、SGC7901和BGC823)48h可引起不同程度的细胞凋亡。 （三）5-FU（2.0μg/mL）作用MGC803细胞6h可见TS三元复合物表达增多，48h表达最强，提示5-FU通过与TS形成稳定三元复合物抑制游离TS酶活性，抑制胃癌细胞增殖。 （四）不同浓度(2.0μg/mL，20.0μg/mL)5-FU作用MGC803细胞48h可诱导线粒体膜电位不同程度下降，提示5-FU通过调节线粒体膜电位诱导MGC803细胞凋亡。 （五）5-FU（2.0μg/mL）作用MGC803细胞48h可明显抑制Bcl-2蛋白表达，对BAX蛋白表达无显著影响，Bcl-2/BAX比值明显下调，提示5-FU可通过调节Bcl-2/BAX比值诱导MGC803细胞凋亡。 二、5-FU作用MGC803细胞增殖信号通路蛋白的表达 （一）5-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可见磷酸化EGFR表达增强，在5-FU作用6h达峰值，在5-FU作用24h磷酸化EGFR表达逐渐下降。 （二）5-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可见磷酸化SRC表达增强，在5-FU作用6h达峰值，在5-FU作用24h磷酸化SRC表达逐渐下降。 （三）5-FU（2.0μg/mL）作用MGC8031h可见磷酸化AKT表达增强，在5-FU作用6h达峰值，在5-FU作用24h磷酸化AKT表达下降。 （四）5-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可见磷酸化ERK表达下降，在5-FU作用24h表达增强，在5-FU作用48h表达最强。 （五）MEK/ERK通路抑制剂PD98059(20μM)作用MGC803细胞24h及48h，可明显抑制5-FU诱导的ERK活化。 （六）PD98059(20μM)及LY294002(25μM)可明显增加5-FU诱导MGC803细胞凋亡(25.42±4.0％，40.63±3.5％)（p值分别为0.011和0.001）。 三、Cbl调节5-FU活性机制的研究 （一）免疫沉淀及免疫印记结果显示，5-FU（2.0μg/mL）作用MGC803细胞24hCbl-b活化增强，持续至48h，提示Cbl-b可能参与调节5-FU抑制胃癌细胞增殖。 （二）建立Cbl-bshRNA稳定转染胃癌MGC803细胞，westernblot结果显示，与Vector组比较，Cbl-bshRNA稳定转染胃癌MGC803细胞无Cbl-b蛋白表达。MTT检测结果显示，与Vector组比较，Cbl-bshRNA组细胞增殖活性增强，48h的IC50值分别为10.67±5.0μg/mL和1.57±0.7μg/mL(p=0.001)。 （三）流式细胞仪检测结果显示，5-FU(2.0μg/mL)作用48hCbl-bshRNA组与Vector组的凋亡百分率分别为18±3.0和32±4.0(p=0.001)。提示Cbl-bshRNA稳定转染胃癌MGC803细胞对5-FU的敏感性下降。 （四）5-FU(2.0μg/mL)作用48h，Cbl-bshRNA组与Vector组的跨膜电位下降百分率分别为18±4.3和30±6.2，p=0.001;5-FU作用72h，Cbl-bshRNA组与Vector组的跨膜电位下降率分别为和37±5.6和63±7.4，p=0.001。结果提示Cbl-b通过调节线粒体膜电位下降诱导胃癌细胞凋亡。 （五）Westernblot结果显示，5-FU(2.0μg/mL)作用48h，与Vector组比较，Cbl-bshRNA组Bcl-2表达上调，Bcl-2/BAX比值上调，提示Cbl-bshRNA组通过上调Bcl-2/BAX比值减少胃癌细胞凋亡，即Cbl-b通过下调Bcl-2/BAX比值诱导胃癌细胞凋亡。 （六）Westernblot结果显示，在5-FU(2.0μg/mL)作用下，与vector组比较，Cbl-bshRNA组EGFR、SRC及AKT的活化时间延长，对ERK的活化无明显影响，对TS的表达也无明显影响。提示Cbl-bshRNA组可能通过活化EGFR/SRC/AKT通路减少胃癌细胞凋亡，也就是说，Cbl-b可能通过下调EGFR/SRC/AKT通路的活化增加胃癌细胞对5-FU的敏感性。 （七）Westernblot结果显示，与vector组比较，5-FU(2.0μg/mL)作用Cbl-bshRNA组TS蛋白表达无明显差异，提示Cbl-b可能不是通过调节TS蛋白表达影响胃癌细胞对5-FU的敏感性。 结论 1、5-FU以时间剂量依赖的方式抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡。 2、EGFR/SRC/AKT信号通路参与5-FU抑制胃癌细胞增殖。 3、Cbl-b通过调节EGFR/SRC/AKT信号通路参与调控5-FU抑制胃癌细胞增殖。