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川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎,具有活血行气、祛风止痛的功效。川芎是著名的川产道地药材,四川都江堰为其传统道地产区。本研究以苓种期健康川芎为材料,分离内生放线菌,筛选对川芎根腐病原菌及常见人体致病菌具有抑制活性的内生放线菌菌株,探究其抑菌活性物质。了解川芎可培养内生放线菌的多样性及其生物活性,初步研究川芎内生放线菌中的抗病菌株和活性天然化合物,为川芎根腐病的生态防治提供基础数据。 首先,采用匀浆法及组织贴片法分离川芎内生放线菌,采用划线法获得内生放线菌纯培养物,结合传统形态、生理生化和分子生物学的方法对川芎内生放线菌进行了分类鉴定。本研究共获得36株川芎内生放线菌,鉴定为4亚目、4科、4属,即链霉菌亚目(Suborder Streptomycineae)链霉菌科链霉菌属Streptomyces;丙酸杆菌亚目(Suborder Prropionibacterineae)类诺卡氏菌科类诺卡氏菌属Nocardioides;微球菌亚目(Suborder Micrococccineae)原小单孢菌科原小单孢菌属 Promicromonospora;小单孢菌亚目(Suborder Micromonosporineae)小单孢菌科小单孢菌属Micromonospora。其中链霉菌为优势菌群,占总菌比列的86%,该属又主要分布于9个类群。 其次,以川芎根腐病病原菌及常见人体致病菌为指示菌考查了川芎内生放线菌的生物活性。结果表明,近27.78%的内生放线菌对川芎根腐病病原菌有较明显的拮抗作用,尤以菌株 FL4、FL6、FL9、F11、F14抑菌能力较强,可用于4种根腐病病原菌的防治。川芎内生放线菌对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)和白色念株菌(Canidia Albicans)等5种人类致病菌表现出了不同程度的抑制活性;其中 F19、FL5、FL7对5种指示菌均有抑制作用,菌株F3可抑制4种指示菌。采用形态、生理生化和及细菌16S rDNA序列鉴定,菌株 F3为链霉菌属 Streptomyces sp.金色类群,菌株 F19为暗灰链霉菌Streptomyces canus,菌株FL5为肿痂链霉菌Streptomyces turgidiscabies,菌株FL7为暗色产色链霉菌 Streptomyces phaeochromogenes。在GenBank数据库中登录号分别为KU975442、KU95442、KU975443和KU975444。 最后,对根腐病拮抗菌株(FL9)的生物活性次生代谢产物进行了研究。采用纸片法对FL9摇瓶发酵产物生物活性及提取分离条件进行考查;再通过扩大培养制备大量发酵液,结合硅胶柱层析、HPLC等方法分离纯化代谢产物;最后对产物进行活性检测及LC-MS检测分析。研究结果表明,FL9的次生代谢产物具有抗根腐病病原菌的活性;从FL9代谢产物中分离获得H5-1及H5-2两个成分,结合文献及LC-MS图谱分析,二者均为由羟基蒽环和糖基构成的糖苷类活性物质。 上述研究表明:川芎内生放线菌多样性丰富,存在生物活性菌株,在川芎病害生态防治和活性天然化合物寻找等方面具有开发利用潜力。