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流感病毒(influenza virus)，是一种能够引起急性呼吸道传染病的病原体。它不仅具有传播迅速，易在人群中散发等特点，还能够造成局部暴发或形成全球范围的大流行，给社会的公共卫生造成极大的负担。流感病毒，属于正粘病毒科（orthomyxoviridae），是一种有包膜的分节段的单股负链RNA病毒。在细胞核内进行基因组的转录与复制是流感病毒复制过程中最重要的步骤之一，其行使转录和复制功能的最小单位是ribonucleoprotein(RNP)复合体。RNP复合体是由流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合体(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)，多拷贝的核蛋白(Nucleoprotein，NP)以及病毒RNA所组成，其中RdRp对病毒基因的转录和复制起到关键性的催化作用。流感病毒RNA聚合酶复合体由PB1、PB2以及PA组成，有研究显示，它不仅决定着流感病毒致病力的强弱，也是流感病毒宿主特异性的决定因素之一。因此，了解RNA聚合酶复合体上各亚基的基本信息，对更好地了解流感病毒的转录、复制机制，以及跨种传播机制，都具有十分重要的意义。 A/Kurume/K0910/2009(H1N1)、A/Beijing/01/2009(H1N1)是2009年分别从日本病人和北京病人体内分离得到的两株H1N1病毒株，在实验室前期研究中发现它们小型复制子系统的活性存在很大差异。为了更好地揭示这种差异存在的原因，我们首先确认了两株病毒在小型复制子水平存在的差异情况。结果显示，A/Kurume/K0910/2009的RNP系统活性明显高于A/Beijing/01/2009，由于RNA聚合酶是决定病毒复制能力的决定因素之一，这提示了造成这两株病毒小型复制子系统活性差异的原因很可能是由不同的RNA聚合酶活性所引起的。接下来，为了排除NP蛋白的影响，我们将两株病毒的RNP系统的NP蛋白都使用来自于同一株的NP蛋白。结果显示，RNA聚合酶活性的差异依然存在，且差异幅度也几乎没有变化，提示了NP蛋白并非两者存在差异的原因，而在于RNA聚合酶的三个亚基。为了找到这种差异存在的可能原因，我们对这两株病毒RNA聚合酶的三个亚基进行了生物信息学分析，发现它们在PA的第206位、PB1的第353、435位、PB2的第251位氨基酸序列上存在显著的不同。我们以A/Kurume/K0910/2009为模板，在A/Beijing/01/2009上分别进行相应的突变，并通过小型复制子RNP系统进行RNA聚合酶活性的比较。结果显示，PA蛋白K206E的突变，使A/Beijing/01/2009病毒株RNA聚合酶活性有明显的升高，而其他位点的突变对RNA聚合酶活性的影响程度远不如PAK206E。 为了能够在病毒水平研究PA206位点，我们引入了A/WSN/1933(H1N1)病毒株，我们将该毒株PA206上的E，突变为K。小型复制子实验显示PA蛋白E206K的突变，明显降低了RNA聚合酶活性，与之前的实验结果相符。进一步，我们分别检测了WSN(wt)以及WSN(mut)的病毒蛋白的表达情况，发现在病毒复制的早、中期(4h，6h)，WSN(wt)的病毒蛋白表达明显高于WSN(mut);然而在病毒复制的晚期(8h)，病毒蛋白表达上的差异逐渐缩小。此外，我们还比较了这两株病毒在生长曲线上是否存在差异，发现在12h、24h野生型病毒的滴度明显高于突变型，但是36h到72h野生型和突变型病毒的滴度没有显著的差异。从这些结果可以看到，PA206上的突变(E-K)对病毒复制能力的影响主要表现在病毒复制的早期，随着多轮复制，这种影响逐渐减小甚至消失。通过结构学的分析，我们了解到PAE206K并没有影响到PA与PB1、PB2的结合，因此我们推测很可能在病毒复制过程中出现了其他的补偿位点。 为了验证我们的推测，在MDCK细胞上复制72h的突变病毒被收集，其基因组8个片段被进行全长的测序分析。结果显示，PB2第518位缬氨酸突变为异亮氨酸、PB2第630位甘氨酸突变为精氨酸、PB2第631位甲硫氨酸突变为苏氨酸。根据病毒的突变情况，我们构建了突变的pcDNA-PB2质粒(V518I、G630R、M631T、V518I G630R、V518I M631T、G630R M631T、V518I G630R M631T),在小型复制子水平研究RNA聚合酶活性的变化，发现这三个位点的同时突变能够提高RNA聚合酶活性，但是否是导致上述实验现象的原因，还有待进一步实验验证。 在结构上，PA206位于PA linker区域，而PA linker上存在多个对RNA聚合酶活性有明显影响的温度敏感的突变位点，我们推测PA206位可能也是温度敏感的位点。因此我们在小型复制子水平，研究WSN-WT与WSN-PAE206K在33℃、37℃、39.5℃条件下RNA聚合酶活性的变化。结果显示，随着温度的升高，WSN-PAE206K的RNA聚合酶活性有非常明显的下降趋势，我们初步确认WSN-PAE206K是温度敏感型的突变位点。 综上，我们通过对RNA聚合酶亚基上的单个突变对RNA聚合酶活性的影响的研究，深化了对流感病毒RNA聚合酶与基因组复制和转录调控的机制的认识，对揭示流感病毒感染和遗传变异及分子演化规律，研制新型抗流感病毒药物和新一代抗流感疫苗有着极为重要的意义。