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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的慢性进行性自身免疫性疾病,患病率高,目前临床治疗药物疗效有限、毒副作用严重,亟待研发高效低毒新型药物。钩吻为历史悠久的药用植物,其生物碱单体钩吻素子,是国产钩吻生物碱单体中含量最高且毒性较小的一种有效成分,具有重大的新药开发价值。课题组前期工作表明,钩吻素子具有显著抗RA效应,该效应与其对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等致炎细胞因子的抑制作用有关,但其作用机制有待深入系统研究。RA发病机制复杂,多种免疫细胞及相关细胞因子参与其发病过程,其中抗原依赖性T细胞尤其T辅助细胞(T helper cells,Th)的活化被认为是发病起始和进展的中心环节。在RA发病时Th细胞出现活化、增殖与极化偏移,其细胞亚群及相关炎症细胞因子构成的网络系统平衡被打破,引起其他效应细胞活化、炎症介质释放及某些降解酶的激活,进而引发RA的炎症过程和骨质破坏。通过调节体内Th1/Th2或Th17/Treg细胞的极化状态可恢复由不同Th细胞及其细胞因子构成网络系统的平衡,实现对RA的发病及病情恶化的控制。本文以Th细胞极化为切入点,循着Th细胞极化过程及其致RA关键效应分子的途径,探索钩吻素子抗RA的调节Th细胞极化作用机制,以期为防治RA新药研发提供新的药物作用靶标与作用途径,也为发展拥有自主知识产权创新药物钩吻素子奠定理论基础,并有助于深化理解RA的发病机制。主要研究内容如下:1钩吻素子对类风湿关节炎动物Th细胞因子偏移的调节作用1.1钩吻素子对Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠的治疗效应及其对模型鼠血清炎症细胞因子的调节作用建立C57BL/6小鼠Ⅱ型胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,以后足厚度、关节炎指数(arthritis index,AI)评分及后足热缩足反射潜伏期(paw withdraw thermal latency,PWTL)为指标观察钩吻素子的治疗作用。动物分为对照组、CIA模型组以及模型鼠钩吻素子处理组(0.4、2和10 mg/kg)、阳性对照药甲氨蝶呤组(1 mg/kg)。初次免疫后第22天开始灌胃给予钩吻素子或生理盐水,每天1次,连续10天,甲氨蝶呤组每两天给药1次。分别在建模前、给药前及开始给药后不同时间进行观察指标的测定,最后一次给药后1 h分别从相应组中随机选取6只小鼠,采血制备全血血清,以Procarta Plex多因子免疫检测及酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术检测细胞因子水平。结果发现,钩吻素子可呈剂量依赖性改善模型鼠足肿胀、热痛敏,降低其AI评分,呈现对CIA小鼠的治疗效应。细胞因子水平检测结果显示,钩吻素子可主要通过抑制致炎细胞因子水平(Th1细胞因子IFN-γ、IL-1β、2、6、12、TNF-α与Th17细胞因子IL-17A)以及致炎性细胞Th1、Th17的正性调节细胞因子水平的升高,调节恢复Th1/Th2、Th17/Treg细胞因子的平衡。1.2钩吻素子对佐剂诱导关节炎大鼠的治疗效应及其对模型鼠血清Th细胞因子的调节作用建立Lewis大鼠佐剂诱导关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)模型,分别以注射足和对侧后足容积、机械痛阈(mechanical withdraw threshold,MWT)以及四肢AI评分为指标观察钩吻素子的治疗效应。根据模型发展特点,设计两种方案,分别考察急性期、慢性期给予钩吻素子对模型的治疗效应,检测各组大鼠血清细胞因子水平,在AIA模型上进一步论证其对Th细胞因子偏移的调节作用。动物分为对照组、AIA模型组以及模型鼠钩吻素子处理组(0.6、3和15mg/kg)、阳性对照药吲哚美辛组(2.5 mg/kg)。急性期方案于建模前1 h开始给药,而后每天1次至建模后第9天,灌胃给予相应药物或生理盐水,分别在建模前与建模后不同时间进行观察指标的测定,在建模前与末次给药后1 h从相应组中随机选取6只大鼠行眼球后静脉丛采血制备全血血清进行细胞因子水平检测。慢性期给药方案于建模后第14天开始给药,每天1次,连续10天,分别在建模前、给药前及给药后不同时间进行观察指标的检测,在建模前、给药前以及末次给药后1 h采血进行细胞因子水平检测。结果表明,急性期给予钩吻素子给药期间仅对AIA大鼠注射足的机械痛敏产生改善作用,对足容积及AI评分的影响无显著性;建模前与建模后第9天,模型鼠血清仅出现IL-17A水平的升高,其余主要Th细胞因子如IL-1β、2、4、6、10、IFN-γ及TGF-β等均未出现显著性改变,急性期给予钩吻素子对模型鼠血清细胞因子没有影响。而慢性期给予钩吻素子治疗可缓解模型鼠注射足与对侧足机械痛敏,并降低AI评分;细胞因子检测结果显示,钩吻素子可降低模型大鼠IL-1β、IFN-γ及IL-17A水平并抑制IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10、IL-17A/TGF-β比值的升高,提示慢性期给予钩吻素子可调节AIA大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞因子的偏移。2钩吻素子对CIA大鼠脾脏Th细胞极化偏移的调节作用建立Wistar大鼠CIA模型,以后足容积和MWT为指标监测钩吻素子的治疗效应。实验分为对照组、CIA模型组以及模型鼠钩吻素子处理组(15、0.6mg/kg),初次免疫后第21天开始灌胃给予钩吻素子或生理盐水,每天1次,连续10天。分别在建模前、给药前及给药后不同时间进行观察指标的测定,在最后一次给药后1 h处死大鼠,从每组中随机选取6只大鼠剥离脾脏,制备脾细胞悬液,以流式细胞术检测Th1、Th2、Th17级Treg细胞相对数量。结果发现,钩吻素子可显著缓解模型鼠足肿胀与疼痛,并对模型鼠脾脏Th1/Th2、Th17/Treg细胞比值的升高产生抑制作用。综上结果提示,钩吻素子对Th1/Th2、Th17/Treg细胞极化偏移状态具有调节作用,进而调节不同Th细胞因子的偏移,恢复Th细胞亚群及细胞因子网络系统的平衡状态,这可能是其发挥抗RA效应的重要机制之一。3钩吻素子对小鼠脾细胞增殖的抑制作用为阐明钩吻素子对Th细胞极化起始阶段免疫细胞活化、增殖的抑制作用,在原代培养的小鼠脾细胞以5溴-2脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)掺入法检测钩吻素子对伴刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)、大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)以及植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)等丝裂原诱导细胞增殖的抑制效应,并以CCK-8法检测钩吻素子的细胞毒性。结果发现,钩吻素子对不同丝裂原诱导的小鼠脾细胞增殖均具有抑制效应,其中较为敏感的是Con A与PHA诱导的脾细胞增殖模型(半数抑制浓度分别为101.3μmol/L与95.28μmol/L),且其效应浓度远低于细胞毒性浓度,提示钩吻素子可选择性作用于T细胞尤其是CD4+T细胞,抑制其在丝裂原诱导下的增殖反应,该效应可能是其发挥对Th细胞极化偏移调节作用的原因之一。上述结果提示,钩吻素子可选择性抑制T淋巴细胞尤其是Th细胞的活化与增殖,进而调节Th细胞亚群的极化偏移与其下游致炎细胞因子/抗炎细胞因子的偏移,恢复Th细胞亚群及其细胞因子网络系统的平衡状态,这可能是钩吻素子发挥抗RA效应的重要机制之一。