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常见的侵袭性致病真菌是院内引起深部真菌感染的主要病原体,许多的疾病发生都与之有关,威胁着人类的健康,特别是那些具有免疫缺陷的病人。致病真菌快速而准确的检测与鉴定有利于有效的预防和控制病原菌感染。本课题的研究目的是建立一种利用寡核苷酸基因芯片对医院内常见的侵袭性真菌进行快速准确的鉴定,其检测范围菌株包括白色念珠菌、季蒙念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、克鲁斯念珠菌和新生隐球菌。
我们通过对8种常见致病性念珠菌和新生隐球菌的间区序列进行比较和分析,确定在18SrDNA的末端和28SrDNA的前端选择通用引物,在5.8SrDNA内的保守区内设计正对照探针,而在间区可变区设计特异性探针。利用软件PrimerPremier5.0分别设计出9种致病性真菌的特异探针,同时设计了针对大部分真菌的阳性对照探针以及阴性对照探针,在不同的探针末端进行poly(T)加尾,利用poly(T)末端的氨基将探针固定在载玻片上,制成寡核苷酸基因芯片；提取真菌基因组后对间区序列进行PCR扩增,纯化扩增产物去除扩增引物,单独利用下游引物进行单链PCR扩增,在反义链中掺入Cy3-dUTP荧光标记,荧光标记后的扩增产物与寡核苷酸芯片上的探针发生杂交反应,通过洗涤,去除芯片上的非特异性杂交和吸附,然后用荧光扫描仪检测杂交信号。对检测体系进行了特异性、灵敏性实验。优化杂交条件,提高杂交效率。
利用72株菌其中包括26株标准菌株和46株临床菌株分别参与了检测芯片探针的筛选和终型芯片性能评估。其中利用20株临床菌株进行了检测芯片的特异性评估,特异探针均显示了高度的特异性:该检测芯片对基因组的最低检测极限为10-2ng/μL。上述实验结果表明本课题利用寡核苷酸基因芯片技术所建立的检测方法具有准确、可靠、实用性强的特点,为医院中常见的深部真菌的快速检测鉴定,提供了一种新的方法和思路。