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目的：
卵巢癌是一类高致死率的妇科肿瘤,90％发生于卵巢表面的上皮组织,其余发生于卵巢的间质细胞和生殖细胞。卵巢表面上皮细胞的特征与正常的上皮组织不同,它具有间质细胞特征。卵巢上皮组织虽然与输卵管和子宫内膜上皮组织胚胎来源相同,但是这两种组织具有正常上皮组织特征能够表达E-cadherin(上皮钙粘素)和其他keratin蛋白。卵巢上皮细胞转变成肿瘤细胞以后才会表现正常上皮特征,如E-cadherin的表达,而其他上皮组织肿瘤在肿瘤发展过程中丢失E-cadherin表达。卵巢肿瘤的组织性分类取决于其在发展过程中所获得的组织特征,如浆液性(输卵管),子宫内膜性(子宫内膜),粘液性(宫颈管内膜)与透明细胞性(中肾上皮组织)。近年来,人们开始从分子生物学的角度着手研究卵巢肿瘤的发生发展,卵巢肿瘤的组织特性和其致癌基因的突变,这两方面的信息促使对卵巢肿瘤新的分类。根据卵巢肿瘤的发展特征的不同,卵巢肿瘤可分为一型和二型。一型卵巢肿瘤发展慢,包括良性、边界性和恶性三个阶段和这种癌症包括低等浆液卵巢癌、粘液卵巢癌、子宫内膜卵巢癌、恶性Brenner肿瘤和透明细胞卵巢肿瘤。其中浆液癌有BRAF和KRAS基因突变,粘液癌有β-catenin和PTEN突变,子宫内膜癌存在微卫星不稳定等。二型卵巢肿瘤发展快,很少见前体肿瘤,恶性程度高,治疗难度大,包括恶性浆液卵巢癌、恶性混和中胚层性肿瘤(mixed mesodermal tumor)和未分化卵巢癌,一般有p53基因突变。
MicroRNA是一类非编码RNA,它们基于与靶mRNA的序列互补抑制翻译起始,或者导致靶mRNA降解,在细胞中发挥重要作用。到目前为止,人们已经发现了几百个miRNA,它们的表达取决于细胞的组织类型。研究已经表明miRNA可能作为潜在的癌基因或抑癌基因。在卵巢肿瘤中,一些miRNA表达升高和一些miRNA低表达,其中miR-200家族高表达,miR-125/miR-100/let-7家族低表达。除了这两个家族以外,miR-199家族、miR-21、miR-221等miRNA也存在表达差异。肿瘤的转移和侵袭能力与细胞的上皮细胞向间质细胞转化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)这一生物化学过程密切相关。最近的研究表明,一些特殊miRNA的表达变化能够促进这一过程,如miR-125a及miR-200家族的低表达能促进卵巢肿瘤细胞的上皮细胞向间质细胞转化,从而提高细胞的转移和侵袭能力。研究表明,miR-214的表达升高与卵巢癌的cisplatin耐药性有直接关系,miR-199a能够抑制某些具有促进EMT过程的基因的表达。
本研究以三种卵巢癌上皮细胞系为研究对象,探讨已经证明的miR-125a、miR-200a、miR-214a和miR-199a的表达差异,并探讨miR-199a与其预测靶基因糖原合酶激酶3β(GSK3β)的可能的关系。
方法：
1、细胞培养,将卵巢上皮癌细胞系A2780、CAOV3和OVCAR3接种到含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中,在饱和湿度37℃、5％CO2的孵箱中传代培养。
2、应用RT-PCR的方法检测E-cadherin、Twist1、DDR1(Discoidm DomainReceptor1)、GSK3β等基因mRNA在三种卵巢癌细胞系中的表达差异。
3、应用实时PCR的方法检测miR-125a、miR-199a、miR-200a和miR-214在三种卵巢癌细胞系中的表达差异。
4、应用Western Blot方法检测蛋白浓度。TargetScan、PicTar、Microcosm等预测miRNA靶基因数据库显示miR-199a能抑制GSK3β。所以我们应用Westernblot的方法检测GSK3β在卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3中的表达差异。
结果：
1、RT-PCR结果显示,E-cadherin在转移细胞系A2780中没有表达,在上皮特征卵巢癌细胞系OVCAR3中有表达。Twist1 mRNA在OVCAR3和A2780中均有表达,但在CAOV3没有表达。
2、实时PCR结果显示,miR-125a、miR-199a和miR-200a在转移细胞系A2780中低表达,而在具有上皮细胞特征的卵巢癌细胞系OVCAR3中高表达;miR-214在cisplatin强耐药性细胞系OVCAR3中的表达高于其在弱耐药性细胞系CAOV3中的表达。
3、RT-PCR结果显示,在不同卵巢癌细胞系中,已经证明的miR-199a的靶基因DDR1表达有差异,在A2780细胞中表达最多,OVCAR中表达最少。miR-199a预测靶基因GSK38在mRNA水平上表达没有明显差异。
4、Western Blot结果显示,在不同卵巢癌细胞系中,miR-199a预测靶基因GSK3B在蛋白表达水平上有明显差异。
结论：
1、本研究表明与卵巢癌细胞转移能力有关的miRNA,如miR-125a、miR-200a及miR-199a,在转移癌细胞系中比未转移中表达低,其中miR-199a表达差异最明显。
2、在三种卵巢癌细胞系中miR-199a的预测靶基因GSK3B的表达水平与miR-199a表达水平相反,这表明它们之间可能存在抑制关系。