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一、目的
采用血浆药理学与现代分析技术相结合的方法，研究姜黄素与其代谢产物四氢姜黄素的体内药动学及对Caco-2细胞上P-糖蛋白功能和表达的影响，研究其逆转肿瘤耐药及药物相互作用的依据。
二、方法：
(一)姜黄素单剂量药动学研究方法1.给药方法采用随机开放试验设计，12名健康志愿受试者单剂量口服姜黄素胶囊4粒(200mg)。
2.生物样本采集方法分别于服药前及服药后0，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24和36h由肘静脉取血5mL置肝素化离心管中，分离出血浆，置-80℃冰箱中保存待测。
3.测定方法
采用HPLC-ESI-MS/MS法测定血浆中姜黄素及其代谢产物四氢姜黄素的浓度。
(二)姜黄素、四氢姜黄素对P-糖蛋白的作用研究方法1．细胞培养以及形态学验证培养Caco-2细胞、脐静脉内皮细胞(ECV304)，用于研究姜黄素和四氢姜黄素对P-糖蛋白功能和表达的影响。Caco-2细胞和ECV304细胞均采用DMEM高糖培养基进行常规培养；细胞荧光免疫法进行细胞膜上P-糖蛋白表达验证。
2．细胞毒性试验采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)，确定姜黄素和四氢姜黄素的体外最大非细胞毒性剂量，保证试验过程中细胞的活性，并为姜黄素、四氢姜黄素对P-糖蛋白功能和表达的作用研究提供与细胞作用的最大浓度。
3．姜黄素、四氢姜黄素和含药血浆对P-糖蛋白功能的影响以ECV304细胞作阴性对照细胞，环孢素A作为P-糖蛋白功能抑制的阳性对照，使用流式细胞术分析姜黄素、四氢姜黄素及含药血浆对P-糖蛋白底物-罗丹明-123(Rh-123)在Caco-2细胞中外排的影响，以此反应P-糖蛋白功能的变化。
4．从蛋白质水平研究姜黄素、四氢姜黄素对P-糖蛋白表达的影响环孢素A作为P-糖蛋白表达上调的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用流式细胞术分析姜黄素、四氢姜黄素对Caco-2细胞上P-糖蛋白表达的影响。 5.从mRNA水平研究姜黄素、四氢姜黄素对MDR1 mRNA表达的影响环孢素A作为MDRl基因mRNA上调的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用RT-PCR技术分析姜黄素、四氢姜黄素对Caeo-2细胞MDR1基因mRNA水平表达的影响。
三、结果：
(一)姜黄素单剂量药动学研究结果1.姜黄素及四氢姜黄素的测定姜黄素和四氢姜黄素分别在0.50～37.50ng·mL-1和1.67～100.00ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，最低检测浓度分别为0.125ng·mL-1和0.500ng·mL-1。萃取回收率均大于71.46％，方法回收率为94.30％～104.43％，日内、日问RSD均小于11.92％，高、中、低三种浓度的质控样品稳定性良好，浓度变异均小于15.00％。
2.姜黄素和四氢姜黄素的药动学参数12名健康志愿者单剂量口服姜黄素后，姜黄素和四氢姜黄素的各项药动学参数如下：tMAX为2.42±1.93h和2.54±2.03h，t1/2为10.67±2.43h和12.66±3.63h，Cmax为11.38±4.90ng·mL-1和37.10±21.98ng·mL-1， AUC0.36为128.13±49.07ng·h·mL-1和309.76±123.93ng·h·mL-1，AUC0-∞为138.83±48.21ng·h·mL-1和343.65+117.39ng·h·mL-1，CL/F为386.69±88.02mL·h-1和158.27±42.37mL-1，V/F为6080.38±2080.80mL和3063.96±1480.17mL。
(二)姜黄素、四氢姜黄素对P-糖蛋白作用的研究结果1.细胞培养以及形态学验证Caco-2和ECV304细胞形态正常；Caco-2细胞高表达P-糖蛋白，可用于研究姜黄素和四氢姜黄素对P-糖蛋白功能和表达的影响；ECV304细胞基本不表达P-糖蛋白，适合作为阴性对照细胞。
2.细胞毒性试验姜黄素和四氢姜黄素分别在小于等于1.0pmol·L-1和5.0μmol·L-1时，与Caco-2细胞培养72小时后，细胞的存活率大于90％。因此，选取姜黄素和四氢姜黄素的最大浓度分别为1.0μmol·L-1和5.01μm0l·L-1，进行其对Caco-2细胞上P-糖蛋白功能和表达影响的研究。
3.姜黄素、四氢姜黄素和含药血浆对P-糖蛋白功能的影响低、中、高浓度(0.1、0.5、1.0μmol·L-1)的姜黄素减少了罗丹明-123在Caco-2细胞内的蓄积(p<0.05)；低、中、高浓度(0.5、1.0、5.0μmol·L-1)的四氢姜黄素减少了罗丹明-123在Caco-2细胞内的蓄积(p<0.05)；三个受试者的峰浓度的含药血浆显著减少了罗丹明-123在Caco-2细胞内的蓄积(p<0.05)；三组药物均增强了P-糖蛋白的外排功能。
4.姜黄素、四氢姜黄素对P-糖蛋白表达的影响在蛋白水平上：在0.1～1.0μmol·L-1范围内，姜黄素组的荧光强度强于阴性对照组(P<0.05)；在0.5～5.0μmol·L-1范围内，四氢姜黄素组的荧光强度强于阴性对照组(P<0.05)。说明试验浓度的姜黄素与四氢姜黄素对P-糖蛋白的表达有诱导作用，且与5.0μmol·L-1环孢素A的诱导作用相当。
5.姜黄素、四氢姜黄素对MDR1 mRNA表达的影响在mRNA水平上：姜黄素组的目的条带光密度值与β-actin光密度值之比大于阴性组(P<0.05)；四氢姜黄素组目的条带光密度值与β-actin光密度值之比略大于阴性组(P<0.05)。说明试验浓度的姜黄素与四氢姜黄素对Caco-2细胞的MDR1基因mRNA表达水平有上调作用。姜黄素的作用与5.0μmol·L-1环孢素相当，四氢姜黄素的作用小于5.0μmol·L-1环孢素A。
四、结论与讨论：1.本文首次报道了姜黄素在中国健康人体内的单剂量药动学。研究显示，姜黄素的生物利用度低且个体差异大。姜黄素进入体内很快转化成葡萄糖醛酸结合物，其主要代谢产物四氢姜黄素在血浆中的浓度显著高于姜黄素，与国外文献报道相似。
2.姜黄素和四氢姜黄素能在较低浓度以及较短时间内(1h)增强Caco-2细胞上P-糖蛋白的活性，增加细胞内Rh-123的外排，从而减少Rh-123在细胞内的蓄积。原因可能是姜黄素和四氢姜黄素在低浓度下能激活ATP酶活性增强了P-糖蛋白的功能，或者与其在短时间内诱导了P-糖蛋白的表达有关。
3.健康受试者口服姜黄素胶囊(降脂通络软胶囊)后，其达峰时间的血浆样品同样能在极短时间内(1h)增强Caco-2细胞上P-糖蛋白的活性，导致Rh-123的外排量增加，且程度略强于试验浓度的姜黄素和四氢姜黄素。由于人血浆中以原形状态存在的姜黄素浓度极低，几乎检测不到，因此含药血浆对P-糖蛋白功能的影响很可能与姜黄素进入人体后未知的代谢物或者降解产物有关。
4．长时间(72h)应用姜黄素和四氢姜黄素可以诱导P-糖蛋白和MDR1mRNA的表达。因此，姜黄素及其代谢产物四氢姜黄素可以通过上调人肠道部位P-糖蛋白和MDR1 mRNA的表达，增强P-糖蛋白外排功能，而引起相应的药物-食物以及药物-药物的相互作用。