【摘 要】
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葡萄是世界重要的果树资源,目前全世界栽培最广泛的葡萄多属于欧亚种群。这些栽培品种虽然品质优良,但是抗病性差,给葡萄生产带来了困扰。中国作为葡萄起源地之一,有众多在抗
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葡萄是世界重要的果树资源,目前全世界栽培最广泛的葡萄多属于欧亚种群。这些栽培品种虽然品质优良,但是抗病性差,给葡萄生产带来了困扰。中国作为葡萄起源地之一,有众多在抗逆方面价值巨大的种质资源,为葡萄分子育种提供了广阔的基因资源。本研究从华东葡萄‘白河35-1’白粉菌诱导cDNA文库中克隆得到VpPR10.1基因,构建植物表达载体,以欧洲葡萄无核白胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。在葡萄遗传转化过程中,使用外源多胺以提高转化效率,获得转基因无核白葡萄材料。主要取得以下结果:1.分别使用腐胺、精胺、亚精胺的不同浓度(10μM、100μM和1000μM)在遗传转化的不同时期(共培养阶段、延迟筛选阶段和筛选阶段)对受体材料进行处理。对于添加多胺处理的时期来说,在共培养阶段添加效果优于在延迟筛选阶段添加,优于筛选阶段添加。对于不同种类浓度而言,腐胺1000μM和亚精胺100μM处理效果较好。研究结果表明:外源多胺优化无核白体细胞胚遗传转化体系的最佳处理为:在共培养阶段,培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+150μM乙酰丁香酮(AS)另添加1000μM腐胺或100μM亚精胺有助于提高抗性胚在筛选阶段中的诱导率。诱导率分别达到了96.2%和88.8%,而对照组诱导率为44.4%。2.通过农杆菌介导的转化方法得到华东葡萄基因VpPR10.1过表达无核白植株70个,经基因组PCR鉴定和蛋白表达水平鉴定出11个转基因植株,阳性率为15.7%。3.使用VpPR10.1过表达转基因株系6904和野生型无核白离体叶片接种霜霉菌,苯胺蓝染色结果显示转基因株系6904上霜霉菌生长较野生型受到抑制,在接种后1-5天的观察期内,接菌后2天菌丝上的吸器数量显著减少;接种5天后统计单位面积产孢量,6904株系离体叶盘上的产孢量也显著降低;DAB染色结果显示,接种后76h、96h转基因株系6904离体叶盘上细胞内活性氧积累较野生型明显,有明显的超敏反应。转华东葡萄VpPR10.1基因能够提高无核白葡萄对霜霉病的抗性。
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