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格列吡嗪是广泛使用的、治疗Ⅱ型糖尿病的第二代口服磺脲类降糖药。体内主要代谢为4-反式-环己烷羟基代谢物(71％)和3-顺式-环己烷羟基代谢物(15％),原形药物和代谢物通过肾脏经尿排出。根据对一位携带CYP2C9*3纯合子的健康高加索人案例分析的报道,单剂量口服格列吡嗪缓释片后血中格列吡嗪暴露量(AUC0-∞)是携带CYP2C9*1纯合子的的445.1％,提示CYP2C9基因多态性可能影响格列吡嗪的药动学。然而,近期一项关于韩国人单剂量口服格列吡嗪缓释片的研究表明,CYP2C9*3杂合子携带者和CYP2C9野生型携带者的药动学参数比较,仅发现CYP2C9*3杂合子携带者平均AUC增加35.2％,其它药动学参数没有统计学差异。以上两项研究提示,CYP2C9基因多态性可能对格列吡嗪的药动学产生影响,但需要进一步的研究证实。由于CYP2C19基因与CYP2C9基因具有较高的同源性,且本实验室的体外实验证明CYP2C19酶也参与格列吡嗪的代谢,考虑CYP2C19基因突变在亚洲人群中分布较高,所以本论文同时研究了CYP2C9和CYP2C19基因多态性对格列吡嗪在中国健康受试者中药动学和药效学的影响。
1.不同CYP2C9和CYP2C19基因型携带者单剂量口服格列吡嗪缓释片的药动学研究
随机筛查了辽宁省142位健康中国男性受试者全血样品,18位携带不同CYP2C9和CYP2C19基因型的受试者被招募参加单剂量口服格列吡嗪缓释片10mg的药动学实验。受试者被分为三组:组一,携带CYP2C9*1/*1和CYP2C19EMs基因型受试者,共10人；组二,携带CYP2C9*1/*1和CYP2C19PMs基因型受试者,共3人；组三,携带CYP2C9*1/*3和CYP2C19EMs基因型受试者,共5人。研究结果表明:与组一比较,组三的AUC0-∞增加了117.5％(P<0.01),t1/2增加了105.6％,CL降低了59.6％(P<0.05),Cmax增加了64.8％。提示CYP2C9基因多态性能显著影响格列吡嗪缓释片单剂量给药后的药动学参数。同样,与组一比较,组二药动学参数具有和组三相似的变化趋势,AUC0-∞增加了44.7％,t1/2增加了108.4％,CL降低了37.6％,Cmax增加了17.2％,但是该组参数的变化均没有统计学意义。携带不同CYP2C19基因型的人群中,格列吡嗪药动学数据呈两相分布,提示CYP2C19基因多态性也能影响格列吡嗪药动学。
2.不同CYP2C9和CYP2C19基因型携带者单剂量口服格列吡嗪片后的药动学和药效学相关研究
随机筛查了辽宁省另外221位健康中国男性受试者全血样品,18位携带不同CYP2C9和CYP2C19基因型的受试者被招募参加单剂量口服格列吡嗪片5mg的药动学和药效学相关研究。受试者被分为三组,每组6人:组一,携带CYP2C9*1/*1和CYP2C19EMs基因型受试者；组二,携带CYP2C9*1/*1和CYP2C19PMs基因型受试者；组三,携带CYP2C9*1/*3和CYP2C19EMs基因型受试者。研究结果进一步证明CYP2C9基因多态性能显著影响格列吡嗪片的药动学过程。CYP2C9*3杂合子携带者的Cmax是野生型携带者的1.3倍,AUC0-∞是野生型携带者的2.0倍。而且,CYP2C9基因多态性能显著影响格列吡嗪的药效学反应。CYP2C9*3杂合子携带者的胰岛素释放增加效应(△AUEC胰岛素0-1h)是野生型携带者的3.8倍。空腹给药一小时后低血糖效应(血糖浓度<3.0mmol/L)的发生率,CYP2C9*3杂合子携带者显著高于野生型携带者(分别为83.3％和33.3％)。另外,也发现CYP2C19基因多态性对格列吡嗪药动学和药效学影响具有与CYP2C9基因多态性相似的趋势。但是,不同CYP2C19基因型组的各参数仍没有统计学差异。
3.不同CYP2C19基因型携带者多剂量口服格列吡嗪缓释片的药动学研究
随机筛查了甘肃省127位健康中国男性受试者全血样品,14位携带CYP2C9*1/*1基因型但携带不同CYP2C19基因型的受试者被招募参加多剂量口服格列吡嗪缓释片5mg的药动学研究。受试者被分为两组:组一,携带CYP2C19EMs基因犁受试者；组二,携带CYP2C19PMs基因型受试者。多剂量给予格列吡嗪缓释片后,弱代谢者组与强代谢者组比较,AUCss是后者的1.5倍(P=0.003),Cmax是后者的1.6倍(P=0.002),口服清除率(CL/F)减少了36.8％(P=0.011),表明CYP2C19基因多态性能显著影响格列吡嗪多剂量给药后的药动学。
4.人体内格列吡嗪的代谢物检测
采用UPLC/Q-TOF法,利用Q1全扫描和产物离子全扫描方式检测口服格列吡嗪片后受试者的尿样和血浆中可能的代谢产物。通过与空白生物样品比较,在尿样中共检测到除原形药物外的5个代谢产物。通过与合成的对照品的质谱和色谱行为进行比较,鉴定了其中的4’-反式-羟基格列吡嗪(M1)、4’-顺式-羟基格列吡嗪(M2)、3’-顺式-羟基格列吡嗪(M3)和3’-反式-羟基格列吡嗪(M4),并确定另一个代谢物为羟基化后与葡萄糖醛酸的结合物。其中尿中浓度最高的是M1、M2和M3,血中未检测到任何代谢物。建立了LC-MS-MS法测定尿样中四种羟基格列吡嗪代谢物的定量方法,对第二项临床实验中18位不同CYP2C9和CYP2C19基因型携带者单次口服给予格列吡嗪片后尿样中代谢物进行了研究。结果表明,CYP2C9和CYP2C19野生型组受试者口服格列吡嗪片后0-6h时间段四种羟基化代谢物累积排泄量要大于6-12h时间段；而在CYP2C19弱代谢者组和CYP2C9*3杂合子组中两个时间段四种羟基化代谢物累积排泄量无明显变化。
5.结论
本研究先后通过三个相互独立的临床实验,研究了CYP2C9和CYP2C19基因多态性对中国健康男性受试者口服格列吡嗪的临床药动学的影响。单剂量口服格列吡嗪缓释片和单剂量口服格列吡嗪片实验结果表明,CYP2C9*3等位基因能显著影响两种格列吡嗪剂型的药动学,CYP2C9*3杂合子携带者的Cmax是野生型携带者的1.3至1.6倍,AUC0-∞是野生型携带者的2.0倍左右。CYP2C9*3杂合子携带者给药后0-1小时胰岛素释放量(△AUEC胰岛素0-1h)明显增加,空腹给药一小时后低血糖效应(血糖浓度<3.0mmol/L)的发生率也要显著高于野生型携带者。而多剂量口服格列吡嗪缓释片实验结果表明,CYP2C19基因多态性能显著影响多剂量给药后的药动学,CYP2C19弱代谢者Cmax是cYP2C19强代谢者的1.6倍,AUCss是CYP2C19强代谢者的1.5倍。
另外,本研究采用超高效液相-高分辨质谱(UPLC-TOF)仪和化学合成的标准品对受试者口服格列吡嗪尿样中四种羟基化代谢进行鉴定。上述四种代谢物均为格列吡嗪环己烷3’位4’羟基化代谢物,它们分别是4’-反式-羟基格列吡嗪(M1)、4’-顺式-羟基格列吡嗪(M2)、3’-顺式-羟基格列吡嗪(M3)和3’-反式-羟基格列吡嗪(M4)。尿中浓度最高的是M1、M2和M3,血中未能检测到任何代谢物。本研究还建立了LC-MS-MS法测定尿样中四种羟基格列吡嗪代谢物的定量方法,对不同CYP2C9和CYP2C19基因型携带者单次口服给予格列吡嗪片后尿样中代谢物进行了研究。结果表明,CYP2C9和CYP2C19野生型组受试者口服格列吡嗪片后0-6h时间段四种羟基化代谢物排泄分数要大于6-12h时间段；而在CYP2C19弱代谢者组和CYP2C9*3杂合子组中两个时间段四种羟基化代谢物排泄分数无明显变化。