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昆虫抗菌肽是昆虫先天免疫系统的重要组成部分,具有抗细菌、真菌、病毒、原虫和癌细胞等广谱活性,其分子量小,作用机制独特,不易产生抗性。在抗生素的抗药性日趋严重的情况下,昆虫抗菌肽极有可能成为新的抗菌药物的来源。
本文通过大肠杆菌诱导斜纹夜蛾幼虫,用FastTrack(k)试剂盒提取诱导幼虫脂肪体mRNA,反转录合成第一链cDNA,进行长距离PCR,cDNA末端钝化,连接EcoRI接头,XhoI酶切,通过Falcon柱,回收大于500bp的cDNA片段,与ZAPExpress(R)载体连接,体外包装后构建cDNA文库。经检测,文库库容为1.5×105,重组率为97.5%,扩增后文库滴度为2.5×108。以文库噬菌体为模板,用特异性引物扩增获得了长度分别为111和114bp的抗菌肽基因cecropinA和cecropinB。
此外,根据真核生物泛素基因高度保守的特点,设计一对简并引物,通过PCR扩增得到了德国小蠊(Blattellagermanica)泛素基因的编码区(GenBank登录号:AY501003)。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8.47kD的蛋白,其等电点为5.73。同源性比较发现,德国小蠊泛素基因与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有94%以上的相似性。
最后,通过PCR方法将德国小蠊泛素基因分别与斜纹夜蛾cecropinA和cecropinB基因融合,并将该融合片段克隆至原核表达质粒pQE30,构建重组质粒pQES1AUb和pQES1BUb。pQES1AUb和pQES1BUb转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导,Western印迹分析表明,融合蛋白的大小为15kDa,与预期大小一致,表明该融合蛋白在大肠杆菌中没有发生剪切。这为在原核细胞中高效表达其他抗菌肽基因提供了新的思路。