论文部分内容阅读
目的：创建一种简便而高效的新方法培养和筛选高活性的供体细胞,以便创建稳定而有效的兔眼视网膜色素上皮(RPE)细胞移植模型。首次验证活体荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记RPE细胞的可行性,并于体外构建CFDA.SE标记的RPE细胞和未标记的RPE细胞混合培养模型,来模拟体内供体、受体RPE细胞血-视网膜外屏障的重建过程,以便深入探讨体内的移植研究。
方法：采用中性蛋白酶Dispase消化分离乳兔RPE细胞,并将其培养于Transwell微孔滤膜上,摸索并调整分离培养的方法和条件。通过Cytokeratin抗体(Clone MNF116)和S-100抗体(Clone SH-B1)进行免疫细胞化学鉴定细胞纯度。并通过单层上皮电阻(TER)的测定研究所培养细胞的屏障功能。将传代后纯化的乳兔RPE细胞悬浮于不同浓度的CFDA-SE染色液中孵育不同时间,根据染色细胞的荧光强度、活性和贴壁率确定CFDA-SE标记乳兔RPE细胞的理想条件。将染色细胞继续贴壁培养,通过流式细胞技术(Flow Cytometry)分析及荧光显微镜观察了解荧光衰减时间。同时对染色初始和4周后细胞表达的部分抗原MNF116和S-100进行对比,然后混合培养染色后兔RPE细胞及非染色的人RPE细胞,检测是否有染料渗漏。最后在体外将CFDA-SE标记的RPE细胞与非标记RPE细胞混合培养于Transwell微孔滤膜上,采用TER测定及紧密连接蛋白ZO-1的免疫荧光分析了解其屏障功能。
结果：采用Dispase消化法成功分离并培养出纯化的乳兔RPE细胞,培养的细胞呈六角形或多角形,分裂旺盛,色素丰富,TER值最高可达到400-450Ω×cm2。采用20μMCFDA-SE于37℃孵育1min为最理想的标记乳兔RPE细胞的条件。流式细胞结果显示染色细胞的荧光于4周内降至原来的0.02％,并且此时的抗原表达与染色初期无明显不同,说明在体外至少可追踪4周。渗漏实验证明此染料未见任何渗漏。成功建立混合培养模型来模拟移植过程,标记细胞与未标记细胞混合培养后可形成单层,呈现铺路石样排列,而且电生理检查结果TER值也可达到400-450Ω×cm2。同时紧密连接蛋白ZO-1表达丰富,呈环行包绕于细胞周围。
结论：通过中性蛋白酶Dispase消化分离乳兔RPE细胞是一种新型的理想有效的方法,可以获得纯化的高活性并接近于体内状态的乳兔RPE细胞,为兔眼自体或同种异体RPE细胞移植提供理想可靠的供体细胞,相关的实践证明可用于体内的移植研究。采用活体染料CFDA-SE标记是一种染色率高,追踪时间长,应用简便安全可靠的标记乳兔RPE细胞的新方法。同时,体外混合培养模型可以重新构建具有生理功能的血-视网膜外屏障,模拟体内的移植情况并探究相关的影响因素,证明活体染料CFDA-SE可用于追踪观察RPE细胞体内移植变化。