论文部分内容阅读
本研究以牛血液的总DNA为模板，PCR扩增牛叠朊编码基因(PRND)的ORF，克隆至pMD18T载体构建重组质粒BoPRND-T。再以BoPRND-T质粒为模板，扩增出编码牛成熟叠朊(bomDpl)的基因片段，与表达载体pET30a(+)连接，构建出含有牛成熟叠朊的编码基因的重组表达质粒pET-bomDpl。酶切鉴定和测序后，转化pET-bomDpl至宿主菌E.coli BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。镍柱亲和层析后，再用电洗脱法纯化融合蛋白。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为15KDa，纯化获得的融合蛋白纯度达到90％以上。
以纯化的融合蛋白作为免疫原，以含有pET30a(+)空载体的E coli BL21(DE3)菌体蛋白作为对照免疫原，分别与弗氏完全佐剂1：1混合乳化，按500μg/只背部皮下注射成年青紫兰兔，在第3周、第5周和第7周用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂进行加强免疫，第4次免疫10天后心脏取血，用间接ELISA法和western-blotting检测抗血清的效价和特异性，用制备的抗血清检测表达产物和牛羊睾丸组织提取物。
检测表明该抗血清的ELISA效价为1：10<5>；ELISA和Western-blotting分析表明，制备的牛叠朊抗血清与重组人、牛和羊的叠朊以及牛和羊睾丸组织中提取的叠朊发生了特异性反应，不与重组人、牛和羊的成熟PrP发生反应，这表明本试验制备的牛成熟叠朊蛋白抗血清可以作为人、牛和羊叠朊的检测试剂和研究其功能的工具。