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目的： 细胞膜表面的糖链（又称聚糖）在细胞识别、黏附、通信联络、免疫应答等方面起着重要作用，与细胞生长发育、感染、癌变等过程紧密相关，在细胞转化与癌变的过程中常发生糖链表达模式的改变。细胞膜表面糖链改变主要与细胞内糖基转移酶表达状况有关。 唾液酸转移酶是糖基转移酶的一种。本实验室前期研究发现，唾液酸转移酶家族中有些成员在肝癌细胞中表达增加（ST3GAL4等），其作用与肿瘤细胞唾液酸增加有关，但是ST3GAL5在肝癌细胞中表达较低而在肝正常细胞中表达较高。 ST3GAL5是α-2，3唾液酸转移酶家族中的一员，也叫做GM3合酶，其作用是催化GM3合成。其表达量的高低已作为检测GM3含量的直接标准。 GM3、GM2属于神经节苷脂，是一类含唾液酸的糖脂，神经苷脂属于糖鞘脂(glycosphingolipids，GLS)，胞膜糖鞘脂合成过程中，乳糖神经酰胺在ST3Gal5催化下合成神经节苷脂GM3，GM3在B4galntⅠ催化下合成神经节苷脂GM2。GLS广泛分布于各类组织和细胞当中，许多成员是肿瘤相关抗原或与细胞生长发育相关，在肿瘤细胞中GLS经常表达混乱，GLS在组织和细胞中的功能是近期糖生物学研究热点。肿瘤细胞黏附于细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的能力对其附着、迁移及侵入起决定性作用。这是由于GLS能作用于细胞表面的重要受体整合素αVβ3V受体。GLS促进肿瘤细胞转移的另一种机制涉及微环境中鞘糖脂-鞘糖脂的相互作用。其中的GM3、GM2可以通过阻断整合蛋白和生长因子受体之间的作用来同时抑制细胞的生长和运动能力。 CD9、CD82同属于跨膜4超家族(TM4SF家族)，其结构为细胞膜糖蛋白，具有4个高度保守的穿膜结构区，广泛分布于多种细胞。CD9和CD82在恶性肿瘤组织中的表达有助于判断疾病的进展与预后。最近研究发现，两者分别能与GM3及GM2结合，对多种肿瘤的转移具有抑制作用。既然CD9和CD82与St3gal5的产物GM3及其下游产物GM2可以共同作用，那么它们的基因表达是否存在相关性并受同一调控机制调控，目前尚无明确报道。 本课题旨在对肝癌细胞系及肝正常细胞系中St3gal5，CD82和CD9的表达情况进行研究，分析三者表达是否有相关性，分析、预测可能调控其表达的转录因子并加以验证，为研究肝癌发生机制提供理论基础，为肿瘤药物治疗提供靶点。 方法： 1、细胞培养 小鼠BNL CL.2、Hepe1-6细胞系培养于高糖DMEM培养液（含10％小牛血清）;人L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系均培养于RPMI1640培养液（含10％小牛血清），置于37℃5％ CO2的培养箱中培养。 2、Realtime PCR检测mRNA表达 Realtime PCR检测L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系（人）及BNL CL.2、Hepe1-6（小鼠）中ST3Gal5、CD9和CD82的mRNA表达情况。 Realtime PCR检测L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系（人）及BNL CL.2、Hepe1-6（小鼠）中转录因子HSF4的mRNA表达情况。 3、转录因子预测 通过生物信息学软件TFSEARCH预测可能存在的共同转录因子结合位点。筛选表达差异明显的转录因子。 4、siRNA干扰 siRNA干扰有差异的转录因子，之后再检测ST3Gal5、CD9和CD82的表达水平。 5、对实验数据进行统计学处理 应用图像采集分析系统分析数据，所得数据用均数±标准差((x)±s）表示，应用统计软件，用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。 结果： 1、ST3GAL5、CD9、CD82表达相关性分析 ST3GAL5、CD9、CD82三种基因在肝细胞系中呈现共表达趋势。ST3GAL5、CD9、 CD82在人肝正常细胞系L-02及小鼠肝正常细胞系BNL CL.2中表达较高，在人肝癌细胞系HepG-2和SMMC-7721及小鼠肝癌细胞系Hepe1-6中表达相对较低。 2、转录因子预测结果 用ST3GAL5，CD82和CD9三个DNA进行转录因子预测，查找前2000bp处是否有相同的转录因子结合位点，其中评分为100的共同的转录因子是:HSF，AML-1a，ADR1。其中HSF转录因子家族广泛存在于哺乳动物中且有报道与癌症相关。 3、转录因子筛选及其与ST3GAL5、CD9、CD82表达的相关性 我们对HSF转录因子家族的全部五个成员进行检测，发现HSF4在肝癌中表达升高（但是人肝癌细胞系HepG-2中HSF4不表达）。 我们采用siRNA干扰技术沉默HSF4基因，检测其在SMMC-7721细胞系（人）及Hepe1-6（小鼠）细胞系中干扰前后的表达情况，同时检测ST3GAL5、CD9、CD82的表达情况。Realtime PCR结果显示:(1)在小鼠肝癌细胞系Hepe1-6中，siRNA干扰HSF4后，ST3GAL5，CD82表达均有升高。然而CD9的表达变化差异不明显。(2)在人肝癌细胞系SMMC-7721中，siRNA干扰HSF4后，ST3GAL5，CD9表达均有升高。然而CD82表达下降。 结论： (1)实验发现ST3GAL5，CD9和CD82在肝细胞中的表达存在相关性，表明双方面共同减少是导致肝肿瘤细胞中增殖迁移能力紊乱的原因之一。 (2)实验结果表明HSF4对ST3GAL5，CD9和CD82在肝细胞中的表达存在负调控机制，然而在不同物种或不同起源的肝肿瘤细胞系中存在着不同的调控机制，其具体作用机制有待进一步研究。