论文部分内容阅读
目的:磷酸肌酸钠(Creatine Phosphate Sodium CP)是一种目前广泛应用于心脏内科及心脏外科的心肌保护剂,磷酸肌酸在体内主要存在于心肌、骨骼肌和脑等高耗能器官的细胞内,主要通过为机体的高耗能细胞,如心肌细胞等,提供能量从而达到保护心肌的目的,但由于肿瘤细胞能量代谢高于正常细胞,因此就磷酸肌酸等能量合剂能否应用于肿瘤患者的治疗一直存在争议,本研究拟通过S180荷瘤小鼠实体瘤动物模型,经不同浓度药物处理后,测量各组平均瘤重,计算抑瘤率,测定肿瘤细胞凋亡率和细胞周期以及S180移植瘤组织内的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen PCNA)蛋白及Bcl-2和Bax表达水平,从而观察磷酸肌酸钠对小鼠S180肉瘤的增殖及凋亡的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:1、建立动物模型和试验分组:将60只体重为20-22克的健康雄性昆明小鼠,随机分为4组(每组15只):生理盐水对照组、CP4㎎/d组、CP8㎎/d组、CP16㎎/d组。将S180肉瘤细胞株接种于各组小鼠右上肢腋窝皮下,建立S180荷瘤小鼠动物模型。2、药物干预:接种后次日开始连续腹腔用药7天后,终止治疗,停药后24小时颈椎脱臼处死全部动物,立即剥离皮下肿瘤,称重,计算抑瘤率。3、流式细胞分析技术(FCM)测定S180移植瘤组织细胞周期、凋亡率及PCNA蛋白表达水平,比较各组之间差异。4、采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测S180移植瘤组织中Bcl-2和Bax的mRNA表达水平,比较各组之间差异。5、免疫组织化学法检测S180肉瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平,比较各组之间差异。6、统计学分析:数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13. 0统计学软件进行数据处理。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小显著法(least significant difference,LSD)作两两比较。P<0. 05为差异有显著性,P<0. 01为差异有极显著性,P>0. 05差异无显著性。结果:1、成功建立荷瘤动物模型。2、平均瘤重及抑瘤率:对照组、CP 4㎎/d组、CP8㎎/d组、CP16㎎/d组平均瘤重分别为(2.51±0.35)g、(2.42±0.31)g、(2.35±0.28)g、(2.22±0.30)g,与对照组相比CP16㎎/d组小鼠平均瘤重降低,差异有统计学意义(P<0.05);其余各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。抑瘤率以CP16㎎/d组最高,为11.60% ;CP8mg/d组次之,为6.38% ;CP 4㎎/d组最低,为4.25%。3、流式细胞分析技术检测结果:(1)、细胞周期及凋亡率:CP16㎎/d组G0/G1期细胞比例(33.30±1.34%)较对照组(32.36±1.12%)上升,差异有统计学意义(P<0. 05);其余各组之间差异均不明显(P>0.05)。CP16㎎/d组S期细胞比例(23.57±1.80%)较对照组(25.25±1.59%)下降,差异有统计学意义(P<0. 05);其余各组间比较差异无显著性(P>0.05)。CP16㎎/d组、CP8㎎/d组、CP4㎎/d组和对照组细胞凋亡率分别为13.21±1.15%、12.98±1.04%、12.70±0.79%、12.53±0.96%,但各组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)、PCNA蛋白:PCNA蛋白的表达在CP16㎎/d组(313.39±7.04)较对照组(319.42±6.49)降低,差异有统计学意义(P<0. 05),其余各组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。4、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果:随着CP剂量的增加Bcl-2及Bax的表达各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2mRNA/BaxmRNA的比值对照组、CP4㎎/d组、CP8㎎/d组以及CP16㎎/d组该比值分别为0.75±0.19、0.75±0.14、0.74±0.17、0.74±0.17,各组间的差别无统计学意义(P>0.05)。5、免疫组织化学法检测结果:Bcl-2和Bax均以细胞浆呈棕黄色颗粒状染色的细胞为阳性表达细胞。随着CP剂量的增加Bcl-2及Bax蛋白的表达各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2/Bax的比值在对照组、CP4㎎/d组、CP8㎎/d组、CP16㎎/d组分别为0.34±0.13%、0.32±0.12%、0.31±0.09%、0.31±0.11%,各组间比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:本研究表明:1、高剂量的CP减轻移植性小鼠S180肉瘤的重量,中、低剂量的CP对移植性小鼠S180肉瘤的重量无影响。2、高剂量CP可下调移植性小鼠S180肉瘤的PCNA指数,并且移植瘤组织的细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞比例下降,抑制了移植性小鼠S180肉瘤的增殖。而中、低剂量的CP对移植性小鼠S180肉瘤的增殖无影响。3、高、中、低剂量的CP对移植性小鼠S180肉瘤的凋亡率无影响,并且对Bcl-2、Bax的表达无影响,Bcl-2/Bax比值无明显变化。高、中、低剂量的CP对移植性小鼠S180肉瘤的凋亡无影响。4、为临床应用CP治疗化疗药物心脏毒性提供了实验依据。