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目的：癌瘤向淋巴结、以及肝、肺等远隔器官侵袭转移是胃癌患者死亡的主要原因，目前胃癌向区域淋巴结及脏器转移机制仍然不明。对胃癌转移机制的深层认识，从基因/分子水平找突破口是解决问题的一条途径。PRL属于一类新的PTP，PRL-3是PRL家族的一个成员。文献报道，PRL-3高表达与多种肿瘤的转移相关。PRL-3和胃癌淋巴结转移相关性分别由Kato等和Miskad等所报道，但目前尚没有研究能够充分证明PRL-3就是肿瘤转移过程中的关键环节。在胃癌转移研究中，要证明PRL-3高表达是胃癌淋巴结转移过程中的关键环节还需要更深入的研究。现有研究由于方法学方面的局限性，未能模拟肿瘤由原发灶向周围及远处转移的特殊内环境变化过程，其结果不可靠。本课题的目的在于，构建携带有PRL-3特异miRNA的慢病毒载体，在胃癌淋巴结转移的动物模型上观察其沉默胃癌PRL-3基因后对胃癌细胞向淋巴结转移的影响，以此评价PRL-3基因在胃癌淋巴结转移中的作用，从而为胃癌淋巴结转移的后续治疗打下基础。
方法：利用Invitrogen公司miRNA网上设计工具，设计并合成3条PRL-3特异pre-miRNA-A，-B，-C；分别构建pcDNA-rPRL-3-miR-A，-B，-C表达质粒并转染SGC7901细胞，RT-PCR和Western Blot检测沉默PRL-3基因效果；选择pcDNA.rPRL-3-miR-C质粒，经标准BP反应和标准LR反应构建重组质粒pLenti6/V5.rPRL-3miR-C，-neg(空载体)；然后该重组质粒与包装质粒ViraPower<'TM>Packaging Mix按比例共转染293FT细胞包装重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C，-neg(空载体)。以10倍为梯度用重组慢病毒感染SGC7901细胞，流式细胞仪检测病毒滴度。Blasticidin筛选感染重组慢病毒的SGC7901细胞，牙科探针在荧光显微镜下挑选荧光强度最高的细胞克隆；RT-PCR和Western Blot法检测沉默PRL-3基因效果。将细胞分成3组：SGC7901(对照)组，Lenti.rPRL3-miR-C组和Lenti-rPRL3-miR-neg(空载体)组，每组8个复孔，分别培养于12孔板中，当细胞生长到融合度为95％时，以1 mL枪头作划痕试验，24小时后计算各组迁移到划痕区域的细胞数。将各组细胞在无血清RPMI-1640培养基中培养过夜，各组细胞在Transwell板上各取6个复孔，下室中加入完整培养基500μL，上室中加入含有1×10<'5>个细胞的无血清培养基100μL，24小时后用棉签去掉隔膜上表面的细胞，然后固定、复染，在100倍显微镜下挑5个不同视野计数隔膜下表面的细胞，计算细胞侵袭力。将0.1 mL含有2×10<'5>的各组细胞种植于无胸腺BALB/c裸鼠的胃大弯浆膜下，第一批实验鼠于术后7周处死，解剖并观察各组胃癌原发灶大小，及其向周围淋巴结、肝、肺等器官组织的转移情况；第二批实验鼠观察至术后120天，记录观察期内的死亡情况，用Kaplan Meier法进行生存分析。
结果：将pre-miRNA-A，-B，-C连接到表达质粒上即可得到重组质粒pcDNA-rPRL3-miR-A，-B，-C，测序表明，3个重组质粒的碱基序列均正确；RT-PCR和Western Blot结果显示pcDNA.rPRL3-miR-C质粒的沉默效果最显著。该质粒和空载体质粒进一步经BP和LR反应重组得到质粒pLenti6/V5.rPRL3-miR-C，-neg，测序表明，两个质粒的碱基序列都正确。将病毒上清加入SGC7901细胞后12小时后即可观察到绿色荧光产生证明慢病毒被成功包装；流式细胞仪检测得到浓缩后的重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C滴度为2×10<'6>TU/mL，空载体重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-neg的滴度为2.5×10<'6> TU/mL。侵袭实验结果显示，侵过基质胶膜的细胞均数为：SGC7901组为109±23/HP；Lenti.rPRL3-miR-neg组为112±15/HP；Lenti.rPRL3-miR-C组为32±10/HP。统计分析表明，Lenti.rPRL3-miR-C组侵过基质胶膜细胞数明显少于其他两组(P<0.05)。迁移力实验表明：SGC7901组的平均迁移能力为23±2.6 cells/mm2；Lenti.rPRL3-miR-neg组为20.8±1.9cells/mm2；Lenti.rPRL3-miR-C组为5±1.6 cells/mm2，统计分析表明，相同面积下Lenti.rPRL3-miR-C组迁移到划痕中的细胞数明显少于其他两组(P<0.05)。动物实验结果显示， SGC7901组胃周围肿大淋巴结平均数目为6.2±1.30个；Lenti.rPRL3-miR-neg组为6.4±1.04个；Lenti.rPRL3-miR-C组为2.3±0.59个，统计分析表明Lenti.rPRL3-miR-C组胃周围淋巴结转移数明显少于其他两组(P<0.05)；SGC7901组远处器官转移率为23.1％；Lenti.rPRL3-miR-neg组为30.8％；Lenti.rPRL3-miR-C组无远处器官转移； SGC7901组胃癌原发灶的平均大小为96.33±10.77mm<'2>；Lenti.rPRL3-miR-neg组为97.64±12.58 mm<'2>；Lenti.rPRL3-miR-C组为74.51±9.90 mm<'2>，统计分析表明Lenti.rPRL3-miR-C组肿瘤原发灶明显小于其他两组(P<0.05)。Kaplan Meier生存分析显示，术后120天时SGC7901平均生存时间是84.63(95％CI：75.57-93.68)；Lenti.rPRL3-miR-neg组为92.25天(95％CI：83.53-100.97)；Lenti.rPRL3-miR-C组为109.67天(95％CI：101.01-118.33)。Log rank检验显示Lenti-rPRL3-miR-C组术后120天内各时点总体生存率明显高于另两组(P<0.05)；SGC7901组和Lenti.rPRL3-miR-neg组之间总体生存率差异不显著(P>0.05)。
结论：人工设计的microRNA对目标基因具有更好的沉默效率，可满足基因功能的研究；重组慢病毒载体可为长时间的动物体内实验提供一个很好的解决方案；沉默PRL-3基因表达可显著减弱人胃癌SGC7901细胞的侵袭能力和迁移能力，在动物体内可显著降低人胃癌原发灶的生长以及其向胃周围淋巴结的转移。可见PRL-3基因在胃癌细胞侵袭转移中起着关键作用，可作为治疗胃癌的一个潜在靶点。