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目的本研究模拟临床中坐骨神经损伤患者在及时手术神经吻合修复后并应用睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF),通过与正常对照组对比,分别观察大鼠术后表现,HE染色,手术后第1、3、7、14、21、28d坐骨神经相应的脊髓阶段免疫组化染色胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)平均吸光度、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal–deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, Tunel)标记的脊髓凋亡运动神经元细胞计数,以探讨CNTF对周围神经损伤后相应脊髓节段GFAP表达的影响、星型胶质细胞(Astrocytes,AS)对运动神经元的保护作用,为临床周围神经损伤手术修复后用药提供一些实验性依据。方法1.模型制备与分组:114只体重200～250g的8周龄健康雄性SD大鼠随机分为对照组(n=6)、模型组(n=36)、生理盐水组(n=36)、药物组(n=36),除对照组外,所有大鼠用体积分数10%的水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,暴露双侧坐骨神经,在距梨状肌下孔约0.5cm处切断坐骨神经,在手术显微镜下以10-0医用尼龙缝合线行神经外膜吻合,每端4针,针距夹角90度,给予抗生素预防术区感染。药物组大鼠术后每日给予1次肌注CNTF100 ng / kg,生理盐水组每日给予1次肌注等量生理盐水。在术后第1、3、7、14、21、28d随机取对照组1只大鼠,取模型组、生理盐水组和药物组6只大鼠,用体积分数10%的水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉后开胸暴露心脏,用粗针头经心尖部穿入主动脉,固定针头,用眼科剪剪开右心耳放血,快速注入温生理盐水200ml,待流出血液变清亮后,快速注入含4%多聚甲醛的PBS固定液200ml,再以200ml相同固定液维持滴注约1h后取材。灌注时可见大鼠眼球变白色半透明,口吐白沫,舌外坠,全身肌肉颤动,四肢抽搐僵直,尾巴僵硬变直,肝脏颜色变浅黄。暴露两侧坐骨神经,取出沿坐骨神经逆行追踪与之相连的L4-6节段脊髓。将脊髓浸泡于含4%多聚甲醛的PBS固定液中。将标本浸泡于固定液24h后石蜡包埋。冠状全层切片,每只大鼠每种染色选两张片厚4～5μm,在45℃水浴中展开,用多聚赖氨酸处理过的载玻片捞取。2.检测方法:HE染色,GFAP免疫组化染色,Tunel法标记凋亡运动神经元。3.结果处理:所得数据均以x±s表示,在Excel数据库整理后用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析,组间同一时间点的比较采用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.大鼠术后表现:术后大鼠都不同程度的出现烦躁不安、食欲减退、体重减轻。在吻合术后观察期间,模型组、生理盐水组几乎全部的大鼠双后肢出现肌肉萎缩、末稍水肿、自嗜等表现,药物组大鼠出现进食早且多,上述症状的程度较低,恢复较快。模型组、生理盐水组大鼠在3周左右双后肢的运动功能都有不同程度的恢复,药物组则在1~2周左右就有所恢复。2.脊髓HE染色:光镜下,可见运动神经元的胞体较大,呈紫红色块状,胞突较多,中央有一个大而圆或卵圆形的胞核,有明显的核仁,核膜清楚,核内染色质少。在神经元的周围有较多分散的蓝紫色的较小细胞核,系神经胶质细胞核。其中,胞核最大、呈圆形或椭圆形、染色质较少者是星形胶质细胞。对照组前角运动神经元细胞核圆形,呈蓝色淡染,位于胞体中央,核仁明显,胞质内尼氏体明显,均匀分布。术后大鼠运动神经元细胞数目减少,细核偏位,尼氏体减少淡染,且可出现空泡细胞,神经元周围的胶质细胞反应性的增多。术后7d各组神经元数量开始明显减少,14d神经元数量减少最为明显。药物组从3d后各时间点神经元计数明显多于模型组和生理盐水组(P<0.05)。3.脊髓前角免疫组化染色:在光镜下观察,星形胶质细胞中GFAP免疫组化染色以细胞浆呈明显的黄棕色为染色阳性。对照组大鼠无明显阳性表达,术后大鼠1d开始GFAP表达逐渐升高,14d时达高峰,与模型组和生理盐水组相比差异有统计学意义(P<0.05),药物组GFAP高表达持续到28d,模型组、生理盐水组GFAP高表达仅持续到14d,到28d时基本恢复正常。4.脊髓前角TUNEL凋亡染色:光镜下,脊髓前角运动神经元凋亡细胞阳性表达在细胞核, TUNEL标记的凋亡细胞特征为细胞皱缩,细胞核染色质浓聚致密的斑点状,核固缩,细胞核碎裂,形成凋亡小体(Apoptsis body)。对照组未见阳性细胞,术后1d大鼠均已出现TUNEL染色阳性细胞,14d达凋亡高峰,21d时明显减少。药物组从3d开始凋亡细胞计数较模型组、生理盐水组明显减少(P<0.05)。结论1.大鼠坐骨神经切断吻合后可诱导脊髓前角运动神经元的凋亡。2.大鼠坐骨神经离断吻合后,应用CNTF可以促进相应脊髓节段GFAP大鼠坐骨神经离断吻合后,应用CNTF可以促进相应脊髓节段GFAP表达。3.大鼠坐骨神经离断吻合后,星形胶质细胞的反应性增生可以减少运动神经元细胞的凋亡数目,对受损的运动神经元细胞有保护作用。4.大鼠坐骨神经离断吻合手术后应用CNTF可以减少运动神经元凋亡的数目。