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肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为目前人类因癌症而死亡的主要原因。非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的70～80％，化学治疗是其主要手段之一。近年来以顺铂为基础的辅助化疗有效地改善了肺癌患者的预后，已经取得了显著的疗效。然而，由于耐药的发生，常常导致肺癌化疗的失败，并限制了铂类药物的广泛应用。如何提高非小细胞肺癌对化疗药物的敏感性，降低化疗药物的使用剂量，减少副作用，提高疗效是其治疗所面临的关键问题之一。肺癌的发生发展是多阶段、多基因、多因素参与的复杂过程，基因的异常先与形态学改变，因此筛选发生率高、特异性强的与肺癌有关的异常基因和针对异常基因的靶向治疗，对非小细胞肺癌诊断和治疗具有重要意义。随着基因治疗研究的不断深入，化疗和基因治疗联合应用成为恶性肿瘤新的综合治疗途径之一。金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类普遍存在的低分子量（6-7KD），富含半胱氨酸的金属结合蛋白。MT对维持一些必需金属的体内代谢平衡及抵抗有毒金属毒性、清除自由基有重要意义。近年来，MT和肿瘤的关系成为研究的热点。MT参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化以及化疗耐药，影响治疗和预后。人类MT基因位于染色体16q13，包括10个功能性基因：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3和MT4。研究表明，不同金属硫蛋白异构体在人发育或在不同生理条件下可能功能不同。各种MT异构体有独特的功能。目前，各个异构体的功能尚不清楚，研究比较多的是MT2A异构体，对于MT1H资料甚少。因此，本课题我们首先利用半定量RT-PCR方法、免疫组化方法分别检测了68例NSCLC组织及25例良性肺组织中MT1H mRNA和MT蛋白表达水平，探讨其在NSCLC发病中的作用和临床意义；然后研究外源性MT1H基因对肺腺癌细胞株A549生物学行为及化疗敏感性的影响，并应用siRNA干扰A549顺铂耐药株A549／DDP中MT1H的表达，反证MT1H在肺癌耐药中的作用；并进一步分析46例NSCLC患者化疗前后外周血MT1H表达情况和顺铂耐药性的关系。通过对肺癌细胞系和临床标本的研究，不但为NSCLC的发生、发展提供理论依据，而且为NSCLC患者化疗药物耐药性寻找新的靶点提供了理论依据。本实验分为以下四部分：第一部分MT1H在人非小细胞肺癌及肺腺癌细胞株中的表达方法：1．采用半定量RT-PCR技术检测68例NSCLC组织及25例良性肺病变组织、肺腺癌A549细胞株及其顺铂耐药株A549／DDP中MT1H mRNA的表达。2．采用免疫组化技术对68例NSCLC组织及25例良性肺病变组织中MT蛋白的表达进行检测。3．统计学处理：利用SPSS10.0软件处理数据，结果用阳性率表示，采用x2检验；相关性分析采用Pearson’s相关分析。以α=0.05为显著性。结果：1．68例NSCLC组织中28例MT1H mRNA表达阳性，阳性表达率为41.2％，25例良性肺病变组织均不表达。2．68例NSCLC组织中47例MT蛋白表达阳性，25例良性肺病变组织中7例表达阳性。阳性表达率分别为69.1％、28.0％。两者对比差异有统计学意义（P＜0.05）。3．MT1H mRNA在高中分化NSCLC中表达阳性率为25.9％，在低分化NSCLC中阳性率为51.2％，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而且，肿瘤分化程度越低，阳性率越高。MT1H mRNA表达与性别、年龄、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移与否均无关（P＞0.05）。4．MT蛋白在高中分化NSCLC中表达阳性率为44.4％，在低分化NSCLC中阳性率为85.4％，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而且，肿瘤分化程度越低，阳性率越高。此外，在≤60岁的患者中阳性率为57.9％，而在＞60岁的患者中阳性率为83.3％，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。MT1H蛋白表达与性别、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移与否均无关（P＞0.05）。5．在MT蛋白表达阳性的47例标本中，MT1H mRNA阳性表达28例，阴性表达19例；在MT蛋白表达阴性的21例标本中，MT1H mRNA也全呈阴性表达；经统计学分析，两者呈正相关关系（P＜0.05）。6．MT1H mRNA在A549／DDP细胞株中高表达而在A549细胞中不表达。第二部分MT1H基因在真核细胞中的表达及其对细胞生长、细胞周期和顺铂耐药性的影响第一章MT1H基因真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达方法：1．用PCR法从含MT1H基因的质粒pACT2-MT1H中获得目的基因cDNA片段，正向插入真核表达质粒pcDNA3.1／myc-his（-）中，构建MT1H重组真核表达质粒pcDNA3.1（-）-MT1H。2．把pcDNA3.1（-）-MT1H以脂质体法转染不表达MT1H的A549细胞，同时转染空质粒pcDNA3.1（-）作为对照。经G418筛选，获得阳性单克隆细胞。3．采用半定量RT-PCR和Western blot技术检测转染前后A549细胞MT1H mRNA和蛋白的表达。结果：1．用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切MT1H真核表达载体，可见释放出192bp大小的片断，与预期目的片断大小一致；进一步DNA序列测定证实，插入片断与Genbank中的已知序列完全吻合。MT1H重组真核表达质粒pcDNA3.1（-）-MT1H构建正确。2．RT-PCR和Western blot结果表明，MT1H转染组MT1H mRNA和带His标签的MT1H融合蛋白均表达，而未转染组和空质粒转染组不表达。MT1H在A549细胞中稳定表达。第二章MT1H基因对A549细胞生长和细胞周期的影响方法：1．采用MTT方法检测MT1H转染对A549细胞增殖的影响。2．采用流式细胞术检测MT1H转染对A549细胞周期的影响。3．采用RT-PCR方法检测MT1H转染对A549细胞周期蛋白CyclinD1的影响。4．统计学处理：结果用均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件包，两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析（ANVOA），以α=0.05为显著性。结果：1．MTT结果表明，与未转染组和空质粒转染组细胞相比，MT1H转染组细胞增殖速度明显增快。MT1H对A549细胞增殖的影响从第三天开始具有显著差异（P＜0.05）。2．流式细胞术结果表明，与未转染组和空质粒转染组细胞相比，MT1H转染组细胞G0／G1期细胞明显减少，S期细胞明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。3．RT-PCR结果显示，空质粒转染组和MT1H转染组细胞CyclinD1 mRNA表达分别为0.27±0.047、0.52±0.060，与空质粒转染组细胞相比，MT1H转染组细胞CyclinD1表达明显升高（P＜0.05）。第三章MT1H基因对A549细胞耐药性的影响方法：1．采用MTT方法检测未转染组、空质粒转染组和MT1H转染组细胞对顺铂（DDP）的药物敏感性，并计算细胞对DDP的IC50值。2．上述3组细胞分别与5μg／ml和10μg／ml顺铂共同孵育24 h，用Annexin V-FITC和PI双染，然后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。3．统计学处理：结果用均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件包，两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析（ANVOA），以α=0.05为显著性。结果：1．A549细胞转染MT1H基因后，加入不同浓度DDP处理，MT1H转染组细胞的存活率明显高于对照组；以转染细胞及对照细胞对DDP的细胞存活率，计算细胞对DDP的IC50值，未转染组、空质粒转染组和MT1H转染组细胞IC50值分别为4.3±0.5、4.0±0.5、14.7±0.6μg／ml。MT1H转染组的IC50值明显高于对照组（P＜0.05）。结果表明：MT1H基因有增强A549细胞对DDP耐药作用。2．流式细胞术结果显示，当DDP浓度为10μg／ml时，未转染组、MT1H转染组细胞凋亡率分别为27.45±2.64％、12.71±0.61％；当DDP浓度为5μg／ml时，未转染组、MT1H转染组细胞凋亡率分别为12.95±1.64％、7.11±0.41％。与未转染组细胞相比，DDP诱导的凋亡在MT1H转染组细胞中显著减弱（P＜0.05）。第三部分siRNA干扰MT1H基因对A549／DDP细胞耐药性的逆转方法：1．将终浓度为10 nM的MT1H siRNA转染到耐顺铂A549细胞（A549／DDP）中，同时转染非特异siRNA作为对照组。2．RT-PCR和Dot blot、免疫组化法检测转染48 h后MT1H mRNA和MT蛋白的表达水平。3．MTT法检测不同浓度DDP对MT1H siRNA转染组和非特异siRNA转染组细胞作用24 h后细胞的存活率，并计算细胞对DDP的IC50值。4．未转染组、非特异siRNA转染组和MT1H siRNA转染组细胞联合化疗药物DDP作用24 h后，用Annexin V-FITC和PI将细胞双染，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5．未转染组、非特异siRNA转染组和MT1H siRNA转染组细胞联合化疗药物DDP作用24 h后，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。6．免疫组化方法检测MT1H siRNA转染前后Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。7．统计学处理：结果用均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件包，两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析（ANVOA），以α=0.05为显著性。结果：1．RT-PCR结果显示，转染48h后，与未转染组和非特异siRNA转染组相比，MT1H siRNA转染组MT1H mRNA水平明显降低，基本不表达；Dot blot和免疫组化结果显示，转染48h后，与非特异siRNA转染组比较，MT1H siRNA转染组MT1H蛋白表达明显下降。2．A549／DDP细胞转染MT1H siRNA后，加入不同浓度DDP处理，根据转染细胞及对照细胞对DDP的细胞存活率，计算不同细胞的IC50值。与未转染组（37.9±1.6μg／ml）和非特异siRNA转染组（36.4±1.8μg／ml）比较，MT1H siRNA转染组细胞IC50值（15.2±1.1μg／ml）明显下降（P＜0.05）。相对逆转率达到67.6％。这表明MT1H siRNA转染增强了耐药细胞A549／DDP对DDP的敏感性。3．流式细胞术结果显示，与未转染组（5.95±0.51％）和对照siRNA转染组（7.80±0.46％）相比，MT1H siRNA转染组（29.02±3.64％）细胞DDP诱导的A549／DDP细胞的凋亡显著增强（P＜0.05）。4．TUNEL检测结果表明，未转染组、非特异siRNA转染组、MT1H siRNA转染组三组细胞联合DDP治疗后，AI值分别为12.6±2.3％、16.3±2.6％、38.4±5.7％，MT1H siRNA组明显高于其它两组（P＜0.05）。5．免疫组化结果显示，未转染组、MT1H siRNA转染组细胞Bcl-2蛋白的表达强度分别为2.28±0.21、0.99±0.14，Bax蛋白的表达强度分别为1.12±0.17、1.35±0.13。MT1H siRNA转染后Bcl-2表达明显下降（P＜0.05）；而Bax变化不明显（P＞0.05）。第四部分非小细胞肺癌患者外周血中MT1H mRNA的表达与顺铂耐药性的关系方法：1．46例非小细胞肺癌初治患者，用含顺铂方案化疗两周期后评价疗效，收集化疗前后外周血，采用RT-PCR方法检测MT1H mRNA表达情况，并探讨其和近期化疗疗效的关系。2．统计学处理：结果用均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件包，进行t检验，以α=0.05为显著性。结果：1．所有标本均表达MT1H mRNA。46例患者中有效26例，无效20例。有效组化疗前MT1H平均表达为0.48±0.27，无效组化疗前MT1H平均表达为0.43±0.17，两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。这表明MT1H可能和顺铂原发性耐药无关。2．化疗前MT1H平均表达为0.46±0.23，化疗后MT1H平均表达为0.56±0.22，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而且随着化疗MT1H表达升高。并且，有效组化疗前后MT1H表达差异无统计学意义（P＞0.05），无效组化疗前后MT1H表达差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示MT1H可能和顺铂继发性耐药有关。结论1．MT蛋白在非小细胞肺癌组织和肺良性病变组织中表达存在差异，并且在癌组织中表达与分化程度、年龄有关。MT1H mRNA在非小细胞肺癌组织和肺良性病变组织中表达存在差异，并且在癌组织中表达与分化程度有关。提示MT蛋白和MT1H可能参与非小细胞肺癌的发生、发展。2．MT1H能够促进肺腺癌细胞A549增殖，可能和上调CyclinD1，促使细胞进入S期增多有关。3．MT1H能促进A549细胞对顺铂耐药，可能和抑制细胞凋亡有关。4．siRNA干扰MT1H表达，能降低Bcl-2表达，增强顺铂对A549／DDP细胞凋亡的诱导作用，有效逆转A549／DDP细胞耐药，在未来可能发展成为非小细胞肺癌一种新的治疗方法。5．晚期非小细胞肺癌患者，化疗前外周血中MT1H mRNA表达和顺铂化疗疗效无关，提示MT1H和顺铂的原发性耐药无关。化疗后MT1H mRNA表达明显升高，有效组化疗前后无差别，无效组化疗前后有差别，提示MT1H可能和顺铂的继发性耐药有关。