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鸡白痢(pullorum disease,PD)是严重危害养鸡业的细菌性传染病之一,病原为鸡白痢沙门菌,主要经卵垂直传播,亦可经消化道,呼吸道感染。目前,对于鸡白痢沙门菌的鉴定主要是采取细菌分离、生化试验、血清学试验等系列经典方法,但这些系列方法耗时费力,有时需2-3周的时间,繁杂的检测程序对检验部门和使用者均是一种沉重的负担,且最终结果尚不一定确实。因此,迫切需要建立一种快速、特异的鸡白痢沙门菌检测方法,这对于鸡自痢的有效防控意义重大。
本研究主要内容之一是,从珠三角多个种鸡场采集样品,以传统微生物学方法作鸡白痢沙门菌的分离鉴定,初步了解和分析现阶段养殖场鸡白痢的流行情况,为当地及邻近地区防控本病提供相关依据。
本研究主要内容之二是,根据鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏flic基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约866bp的产物,用Hinpll对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌,建立鸡白痢一鸡伤寒沙门氏菌RFLP分析法。
本研究主要内容之三是,进一步根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达18 pgDNA,4.7×104CFU/mL的菌液。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。
研究最后将鸡白痢沙门菌标准株、分离鉴定株人工感染病例作为被检样,同步采用传统微生物学方法、RFLP分析法和等位基因特异性PCR方法进行分离鉴定程序简繁及可靠性的初步比较,表明采取少量鸡白痢感染小鸡内脏组织(肝、肺和关节液等)作为被检材料,传统微生物学方法至少需要1周的时间,RFLP分析法至少要40h,而等位基因特异性PCR方法只需:将病料放入含LB液体培养基的2mL,EP管中,150r/min,37℃振荡培养4h,取2μL菌液直接进行PCR扩增,可以在6 h时间内,特异、敏感、快速的完成鸡白痢沙门菌的分离鉴定。