三种鳜属鱼类GH基因的序列及多态性研究

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本研究以翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)、大眼鳜(Siniperca kneri)、斑鳜(Siniperca scherzeri)为研究对象,采用长片段PCR技术及T-A克隆技术,首次成功克隆获得三种鳜属鱼类GH(生长激素)基因含完整阅读框DNA全序列,对其序列结构、编码氨基酸序列、序列间差异及系统发育等进行了研究,并根据GH基因各区域序列特征综合运用PCR-SSCP、PCR-RFLP、微卫星、内含子长度多态性检测及测序等多种方法对三种鳜属鱼类东洞庭湖野生群体进行了GH基因多态性检测及群体遗传结构分析。这些研究从生长激素基因的角度揭示了三种常见养殖鳜类间生长性状差异的分子遗传背景,为鳜鱼的分子育种奠定了基础。主要研究结果如下:1、翘嘴鳜GH基因序列全长5548bp,大眼鳜GH基因序列全长5483bp,斑鳜GH基因序列全长5789bp,均含有6个外显子和5个内含子。将三个序列作为翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜GH基因序列提交GenBank数据库,经审核通过,获得注册号,分别为EF205280、EF205281、EF441623。在本研究中,采用长片段PCR技术直接从基因组DNA成功克隆较大的基因,显示了该技术在后基因组时代生物基因组研究中的良好应用前景。2、经对三种鳜属鱼类GH基因DNA序列进行比较,发现三者差异主要存在于第1、2、3内含子。第4、5内含子及外显子差异较小。三种鳜鱼GH基因序列差异主要表现为邻近序列的重复、DNA片段的缺失或插入及单碱基差异。3、从GH基因DNA序列推导氨基酸序列,翘嘴鳜与大眼鳜在GH氨基酸序列水平上不存在种间差异,两者与斑鳜间仅存在第150位氨基酸差异。在该处,斑鳜为蛋氨酸(M),翘嘴鳜、大眼鳜均为亮氨酸(L)。4、在三种鳜鱼GH基因第二内含子中,均发现AG微卫星重复序列。经在群体中检测,该位点具有较高多态性。成功开发出了鳜属鱼类位于已知功能基因内部的具有丰富多态性的微卫星位点。该微卫星标记极有可能与生产性状相关。5、在三种鳜鱼GH基因第三内含子术端,均发现一处第三内含子与第四外显子交界处37bp极端保守序列的重复。从GenBank数据库下载的其余十一个物种GH基因中,除尖吻鲈GH基因在第三内含子末端具有该序列的不完全重复外,4种鲈形目鱼类及6种非鲈形目脊椎动物GH基因均缺少该重复序列。6、经采用PCR-SSCP、PCR-RFLP、微卫星、内含子长度多态性检测及测序五种检测方法结合对翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜三个群体进行序列多态性检测,七个位点共检测到38个单倍型。其中,31个单倍型为单个物种独有单倍型。各单倍型在种间的分布具有较强的物种特异性。7、经序列比较及群体中多态性检测发现,GH基因第1、2、3内含子长度在三种鳜鱼间具有种间特异性。8、在GH基因7个位点中,斑鳜的多态位点数为6个,其他两个物种的多态位点数为5个。斑鳜、大眼鳜、翘嘴鳜的位点平均等位基因数分别为2.43个、2.43个、1.86个,平均有效等位基因数分别为1.5个、1.35个、1.36个。斑鳜遗传多样性(0.44)略大于翘嘴鳜(0.38)及大眼鳜(0.35)。9、在三种鳜鱼野生群体中,对遗传多样性在种间及种内分布情况分析结果表明,种内多样性占总体多样性的29.7%,种间多样性占总体多样性的70.3%。GH基因多样性主要以种间多样性形式存在。各位点平均Fst值(物种分化指数)为0.68,Nm(基因流)平均值为0.12。物种间分化较大,种间基因交流较少。10、利用三种鳜鱼GH基因全序列及各位点多态性检测结果分别构建系统发育树,两者拓扑结构一致。在系统发育树中,翘嘴鳜与大眼鳜首先聚为一支,然后再与斑鳜聚为一枝,说明在系统进化中,斑鳜可能最先从共有祖先物种中分化出来。
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