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本文利用高速逆流色谱最新分离技术,并采用双水相体系,对cIFN蛋白制备品中的两种异构体分离纯化进行了探索,获得了纯度较高的cIFN单体蛋白,为临床上提供高质量、高纯度的活性蛋白提供了保证；与此同时为进一步研究发酵过程中,cIFN发生聚合和降解的机理,提供了物质基础.本文主要研究结果包括:
建立了反相、双水相高效液相色谱分离cIFN异构体的方法,利用面积划分法测定双水相体系分配系数.分析研究了双水相系统中缓冲盐种类浓度,pH值,PEG浓度及分子量大小等参数均对体系分相时间,固定相保留率和蛋白质的分配系数等的影响；特别发现了不同PEG分子量及浓度明显影响cIFN制备品中两种蛋白质的分配系数,且对系统保留率及稳定性也有影响.
采用上海同田生化有限公司生产的TBE-200V型高速逆流仪器,优化筛选3％PEG2000-10％PEG4000-12％柠檬酸三钠-2％柠檬酸双水相体系,成功分离了cIFN制备品中两种干扰素单体:I号洗脱峰纯度为99.4％,回收率达到90.9％；II号洗脱峰纯度为98.6％,回收率达到92.3％.并且利用13％PEG4000-12％柠檬酸三钠-2％柠檬酸双水相体系,对从发酵上清液中直接分离cIFN单体蛋白进行了初步尝试,其分离纯度达到了83.3％.
为进一步提高发酵液中cIFN单体的表达量,本实验还在5L发酵罐上考察了添加不同浓度Tween-80,以及诱导开始后不同诱导时间添加Tween-80对单体cIFN蛋白含量及活性的影响.结果发现:诱导相温度25℃时,添加0.01％(w/v)Tween-80就能明显抑制cIFN发生聚合,单体百分含量从41.2％显著提高到82.4％；添加0.04％(w/v)Tween-80后,生物活性从1.91×108IU/ml上升到3.73×108IU/ml；且发现当在诱导开始后不同时间加入0.02％(w/v)Tween-80时,添加后约12小时cIFN单体表达量均有明显提高.