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microRNA (miRNA)是近年来生命科学领域中一个颇受推崇的研究热点,它是近年发现的一类对基因表达调控具有非常重要的调节作用的小分子RNA[1],它们存在于人类和几乎所有生物中,是一类保守、短序列的单链小分子RNA,其长度约为21～25个核苷酸,成熟的miRNA在细胞质中通过与其靶基因mRNA的3’端非编码区(3’-UTR)互补结合,使得靶mRNA被降解或靶基因的表达受到抑制。研究结果证实miRNA作为一种转录后调节因子,在高等真核生物的基因表达、个体发育、细胞的增殖与分化、动物进化和人类疾病发生等方面有重要的作用。miRNA参与基因表达调控的平衡网络系统,决定细胞的命运,当这种平衡被打破后,能诱导肿瘤的发生。调控miRNA的表达有望在疾病的治疗方面发挥重要作用。反义核酸技术是近年来分子生物学领域兴起的一种新技术,现在已经成为肿瘤基因治疗方面新的研究热点。反义核酸通过与特定的mRNA互补来封闭某些基因的表达,使其不表达或低表达,从而调控细胞的生长状态。反义核酸可以通过质粒或病毒的表达载体在细胞内表达产生,也可以通过诱导剂诱导细胞内产生某些反义核酸,还可以通过人工合成之后再导入细胞内发挥作用。miR-20、miR-106是miR-17家族的成员,具有癌基因样功能,可促进细胞增殖；通过抑制这类具有癌基因功能的miRNA在细胞内的表达,则可显著抑制肿瘤细胞的增殖。目前,反义核酸主要针对mRNA进行研究,针对miRNA的反义核酸还处在初始阶段。本研究中,我们设计并合成了特异性针对miR-20和miR-106的反义核酸,通过脂质体法转染到293T细胞内,进一步通过各种方法来探索它们对293T细胞的作用及可能的机制,探讨反义核酸在调节细胞增殖以及肿瘤治疗中的应用价值。特异性针对miR-20和miR-106的反义核酸在转染293T细胞后,倒置显微镜下可见细胞生长速度减慢,大量细胞皱缩,聚集成簇,细胞数目明显减少,出现大量凋亡细胞；通过MTT法检测细胞生长活力,发现活细胞数目明显减少。为了观察细胞凋亡情况,我们使用Annexin V-FITC凋亡试剂盒对细胞进行染色后,荧光显微镜观察可见,转染miR-20和miR-106反义核酸后,视野内有大量细胞发出绿色荧光和红色荧光,与对照组相比,凋亡细胞数明显增多；进一步通过流式细胞仪检测,发现转染反义-miR-20和反义-miR-106组细胞的凋亡率均显著高于对照组,进一步说明反义核酸可以诱导细胞凋亡。为了探讨反义核酸诱发细胞凋亡的机制,我们通过RT-PCR和Real-time PCR来检测细胞内miR-20和miR-106的表达情况,结果发现,反义-miR-20可以显著降低细胞内miR-20的含量,同样,反义-miR-106也可以显著降低细胞内miR-106的表达。研究中我们通过microRNA TargetScan (http://www.targetscan.org/)、microRNA.org(http://www.microma.org/microma/home.do)和mirbase(http://www. mirbase.org)三种预测软件分析miR-20、miR-106可能调控的下游基因,并选取RB基因进行进一步的研究。ELISA法结果显示,转染了反义-miR-106的细胞中RB蛋白的表达水平显著升高,而转染了反义-miR-20的细胞中RB蛋白的表达水平无明显变化。这一结果说明,miR-106可能通过调控RB蛋白的表达,进而影响细胞的增殖；而miR-20对细胞增殖与凋亡的机制有待于进一步研究。总之,本课题研究结果表明,反义核酸可明显抑制293T细胞的增殖,促进细胞凋亡；反义核酸可有效抑制细胞内miR-20和miR-106的表达；研究还表明反义-miR-106通过抑制miR-106表达,进一步上调抑癌基因RB的表达。