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本研究主要探讨O-GlcNAc糖基化在水牛胚胎早期发育过程中的作用机理和水牛转基因克隆的相关影响因素,以便建立一套较为完善的水牛转基因克隆技术体系。具体的研究结果如下。1、建立了水牛早期胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白和(beta-O-linked N-glycosylation, O-GlcNAcylation)相关基因的表达检测方法。免疫荧光染色抗体浓度优化的研究结果发现,当一抗浓度为1：200,二抗浓度为1：1000时,可清晰地观察到经抗体免疫后O-GlcNAc蛋白的分布,可用于O-GlcNAc蛋白的表达情况检测分析。为建立O-GlcNAc糖基化相关基因(GFPT、OGT和OGA)的mRNA表达荧光定量PCR检测分析方法,根据NCBI中GenBank所提供的人或牛GFPT、OGT、OGA基因的CDS序列设计水牛相关基因的PCR引物,克隆得到水牛的GFPT、OGT和OGA基因CDS序列,然后根据该序列设计合成实时荧光定量PCR引物。结果显示,PCR的CDS产物无杂带,条带均一,为特异性的目的片段扩增产物；QRT-PCR的熔解温度均一,熔解曲线表现为尖锐的单一峰,证实引物的有效性,说明该QRT-PCR体系可用于检测水牛早期胚胎GFPT、OGT和OGA基因的表达。2、以水牛孤雌激活(PA)、体外受精(IVF)和体细胞核移植(SCNT)早期胚胎为研究对象,研究分析了水牛早期胚胎发育过程中O-GlcNAc蛋白及相关基因(GFPT、OGT和OGA)的表达模式。免疫荧光染色结果显示,水牛PA、IVF和SCNT胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白水平呈现相似地变化趋势,即从2-细胞期开始慢慢增加,到囊胚期达到最高；其中,IVF胚胎各阶段O-GlcNAc蛋白水平均显著高于SCNT和PA组(P<0.05),而SCNT胚胎各发育阶段O-GlcNAc蛋白水平显著高于PA组(P<0.05)。QRT-PCR的检测结果发现,水牛PA.IVF和SCNT胚胎的GFPT基因mRNA表达水平呈现先升后降的变化趋势,即从2-细胞到4-Cell期表达量升至最高,然后逐渐下降,到囊胚期达到最低;其中,GFPT的表达量在IVF胚胎各时期中表达量最高,均显著高于PA禾SCNT胚胎组(P<0.05),而SCNT胚胎组在8-细胞期后GFPT的表达量显著高于PA组(P<0.05)。OGT基因的mRNA表达量随着胚胎的发育逐渐增加,至囊胚期达到最高；其中,IVF胚胎各阶段OGT的mRNA表达量均显著高于PA胚胎(P<0.05),而在8-细胞期和桑椹胚期显著高于SCNT胚胎(P<0.05)。OGA基因的mRNA表达量从2-细胞期到4-细胞期呈下降趋势,而后又逐渐升高,到8-细胞期表达量达到最高,而后开始下降,到囊胚期降到最低,且IVF各个发育时期的胚胎OGA的mRNA表达量显著高于PA胚胎(P<0.05),但SCNT的8-细胞期和囊胚期胚胎OGA的mRNA表达量显著低于IVF胚胎(P<0.05)。3、研究探讨了糖基化底物—氨基葡糖(glucosamine, GlcN)对水牛早期胚胎发育、O-GlcNAc蛋白及相关基因表达水平的影响。当在PA、IVF和SCNT胚胎培养的0-72h添加不同浓度的GlcN(0、1、2和4mmol/L)时,2mmol/L组的囊胚率均显著高于对照组(23.75%vs13.38%；26.16%vs14.29%；25.52%vs12.70%,P<0.05),而各组之间分裂率差异不显著(P>0.05)。IF染色观察的结果显示,在各类水牛早期胚胎培养的0～72h添加2mmol/L GlcN, PA胚胎发育各阶段O-GlcNAc蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)；IVF胚胎除囊胚期外,其它各发育阶段O-GlcNAc蛋白水平均显著高于对照组(P<0.05); SCNT胚胎除8-细胞和桑椹胚期外,其它各发育阶段均显著高于对照组(P<0.05)。QRT-PCR检测结果显示,在水牛胚胎培养的0-72h添加2mmol/L GlcN, PA胚胎各发育时期的GFPT基因mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05)；而IVF胚胎在4-细胞期和SCNT胚胎在4-细胞和8-细胞期的GFPT表达量均显著高于对照组(P<0.05),其它各发育阶段与对照组差异均不显著(P>0.05)。在胚胎OGT的表达方面,PA胚胎2mmol/L GlcN添加组在4-细胞期、IVF胚胎在囊胚期和SCNT胚胎2-细胞期和囊胚期的OGT表达量与对照组差异不显著(P>0.05),其余各阶段的OGT表达量均显著高于对照组(P<0.05)。在胚胎OGA的表达方面,IVF胚胎2mmol/L GlcN添加组在4-细胞期、8-细胞期、桑椹胚和囊胚期,SCNT胚胎在4-细胞期OGA表达量与对照组差异不显著(P>0.05),其它各阶段均显著低于对照组(P<0.05)。研究发现,在水牛胚胎发育0-72h间添加适宜浓度的O-GlcNAc蛋白糖基化底物(2mmol/L GlcN)有利于提高早期胚胎的发育能力；而且也可以促进早期胚胎O-GlcNAc蛋白的表达,上调OGT和GFPT基因,下调OGA基因的表达水平,从而促进胚胎的发育。4、主要探讨了影响供体细胞转染效率及转基因克隆胚胎发育的相关因素。电穿孔法、脂质体法、磷酸钙法及慢病毒法转染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)筛选获得的转基因细胞作为核移植供体韵研究结果显示,电穿孔法构建的重构胚表达标记基因EGFP的阳性分裂率(48.00%)和阳性囊胚率(18.58%)极显著高于磷酸钙法(0%和0%)、慢病毒介导法(0%和0%)和脂质体包埋法(5.60%和3.72%)。采用电穿孔法二次转染BFF,其重构胚分裂率和囊胚率均略高于一次转染,但是差异不显著(71.23%vs68.37%；24.66%vs18.37%,P>0.05)。将内部核糖体接入位点(IRES)插入到表达载体与未插入IRES基因的表达载体比较发现,表达载体pEGFP-IRES-NEO的转基因克隆重构胚分裂率、阳性分裂率、阳性囊胚率均显著高于pEGFP-N1表达载体(71.43%vs57.77%；39.14%vs8.35%;17.64%vs5.20%,P<0.01)。将pEGFP-IRES-NEO表达载体进行单切或双切后分别转染供体细胞,单切载体重构胚的阳性分裂率和阳性囊胚率高于双酶切载体,但两组间差异不显著(37.39%vs32.41%；9.66%vs8.30%,P>0.05)。同时,在比较不同代数(6-10代)的供体细胞构建转基因克隆重构胚时发现,重构胚早期胚胎分裂和囊胚期EGFP表达率差异不显著(P>0.05)。不同性别的供体细胞转染EGFP基因用于构建核移植重构胚的结果显示,雌性细胞组阳性分裂率和阳性囊胚率显著高于雄性供体细胞组(67.63%vs42.76%；22.54%vs10.52%,P<0.05),分裂率和囊胚率也高于雄性供体细胞组,但差异不显著(71.10%vs68.42%；26.59%vs21.71%,P>0.05)。将得到的含有EGFP基因的6-8天囊胚进行胚胎移植,得到了表达EGFP的转基因克隆水牛5头,双胞胎中的一头不幸死亡。经过鉴定确认转基因克隆水牛表达EGFP基因。此外,用转干扰素(IFN)、生长素(GH)、促乳素(PRL)基因的供体细胞进行核移植,三种基因的转基因克隆胚胎分裂率、阳性分裂率、囊胚率和阳性囊胚率差异均不显著(66.44%vs62.50%、59.23%；54.11%vs57.35%、51.63%；17.81%vs19.12%、20.65%；16.44%vs13.60%、14.67%,P>0.05),且经胚胎移植给受体水牛后获得妊娠。上述结果表明：(1)电穿孔法较磷酸钙法、脂质体法和慢病毒转染法更适合制备转基因克隆水牛,使用该法能获得转基因克隆水牛；(2)水牛转基因克隆效率受供体细胞性别的影响,雌性胎儿成纤维细胞优于雄性,但不受供体细胞转染次数、代数以及载体的酶切方法的影响；(3)携带GH、IFN和PRL的转基因载体能够用于水牛转基因克隆胚胎生产,且胚胎移植后均可以在体内妊娠并进一步发育。5、探讨了Trichostatin A (TSA)处理供体细胞和转基因克隆重构胚对水牛转基因细胞表达EGFP及克隆重构胚发育的影响。流式细胞仪检测分离、纯化后的供体细胞结果显示,随着转EGFP供体细胞代数的增加(7-11代),表达EGFP细胞的数目有所降低,差异不显著(P>0.05)。将转EGFP基因的细胞分别用浓度为5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L TSA处理24h后显著提高细胞G0/G1期的比例,且从10nmol/L起表达EGFP细胞的数目开始显著地增加(P<0.05)。 TSA浓度为5nmol/L、10nmol/L时,乙酰化水平显著高于对照组(P<0.05),且供体细胞DNA甲基化水平显著低于对照组(P<0.05)。TSA处理24h供体细胞后进行核移植的结果发现,TSA浓度为10nmol/L时,重构胚的分裂率(85.71%vs60.40%)、阳性分裂率(84.82%vs55.45%)、囊胚率(49.11%vs26.73%)和阳性囊胚率(49.11%vs21.78%)显著高于对照组(P<0.05)。将转基因克隆重构胚后用5nmol/L、10nmol/Lv50nmol/L或100nmol/L的TSA处理6h后发现,50nmol/L TSA组的重构胚的分裂率(83.33%vs69.70%)、阳性分裂率(82.41%vs60.61%)、囊胚率(45.37%vs29.29%)和阳性囊胚率(43.52%vs21.21%)均显著高于对照组(P<0.05)。用50nmol/L TSA对重构胚分别处理3h、6h、9h或12h后发现,处理时间为9h的重构胚分裂率(86.17%vs74.31%)、阳性分裂率(82.20%vs70.64%)、囊胚率(49.15%vs33.94%)和阳性囊胚率(47.46%vs32.11%)均显著高于对照组(P<0.05),其余各组与对照组相比差异不显著。此外,水牛转基因克隆胚胎的乙酰化水平及相关基因的表达水平检测结果显示,50nmol/L TSA处理重构胚9h,能显著提高胚胎的乙酰化水平(P<0.05),显著提高HAT1基因的表达(P<0.05),显著降低HDAC1基因的表达(P<0.05)。以上结果表明：(1)转EGFP的水牛胎儿成纤维细胞随着细胞代数的增加(7-11代),表达EGFP细胞的数目呈逐渐降低的趋势；(2)采用10nmol/L的TSA处理供体细胞24h不但可以显著提高转EGFP基因水牛胎儿成纤维细胞处于G0/G1期的比例和表达EGFP细胞的数量,而且能提高细胞组蛋白H3K14组蛋白乙酰化水平,且降低细胞DNA甲基化水平,提高其核移植后的转基因克隆胚胎的体外发育率；(3)适当浓度(50nmol/L)的TSA处理水牛转基因克隆重构胚一定时间(9h),能提高水牛转基因克隆胚胎的乙酰化水平,且胚胎的HAT1表达水平显著上升,HDAC1的表达水平显著下降,从而促进水牛转基因克隆胚胎的发育能力。