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目的：迟缓爱德华菌(Edwardsiella trada，简称Et)是在水产养殖中重要的病原菌，能引起多种水产养殖动物，如鱼类、鳗鱼、龟鳖、牛蛙等的疾病。迟缓爱德华菌还是一种人畜共患病的病原菌，是爱德华菌属中唯一感染人的成员。预防和治疗水产养殖动物迟缓爱德华菌感染主要使用抗生素，这涉及到食品的安全问题。接种疫苗作为一种安全可靠的预防手段，已得到大家的公认，但目前尚无有效疫苗的应用。尽管已发现Et的一些重要的致病因子，如溶血素、载铁体、肠毒素等，但其致病机理仍不明确。因此，对迟缓爱德华菌的毒力因子及其调控的进一步研究，有助于发现新的致病机制和疫苗靶点。本实验旨在研究Et溶血素活化基因(Et haemolysin activator gene，eha)的生物学特性和调控作用，并构建其缺失株。方法：构建重组载体pET28a~+-eha，转化大肠埃希菌BL21，利用IPTG诱导大肠埃希菌表达EHA蛋白，菌体超声裂解物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，检测其纯化蛋白溶血活性及Vero细胞毒性。将eha重组质粒pED101和载体pACYC184分别转入大肠埃希菌DH5α中，利用RT-PCR及SDS-PAGE电泳，观察eha基因调控大肠埃希菌染色体上的细胞毒clyA基因的转录和表达。构建eha基因重组自杀质粒，利用同源重组原理，缺失Et的eha基因，并用PCR证实。结果：成功构建了pET28a~+-eha重组质粒，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示表达出一条17 kDa左右的条带，纯化蛋白无溶血性及Vero细胞毒性。将eha重组质粒pED101转化入大肠埃希菌DH 5α中，其克隆子表现出溶血性，SDS-PAGE电泳显示克隆子有一条30 kDa左右的蛋白条带，与clyA蛋白分子量一致，RT-PCR显示其有约1000 bp的条带，也与clyA符合，而载体pACYC184转化入大肠埃希菌DH 5α中，其克隆子无溶血性，SDS-PAGE电泳和RT-PCR均未显示相应的条带。成功构建了eha基因重组自杀质粒，通过电转，将之转入Et中，得到了eha缺失株，用PCR证实Et eha缺失株中eha基因已部分缺失。结论：通过以上试验，初步证明了eha基因不是一个溶血素基因，而是一个调控基因，能够调控大肠埃希菌DH 5α中“沉默”的溶血素基因clyA的转录和表达。构建的Et菌的eha缺失株，为今后进一步探讨eha基因在Et菌中的致病机制的作用打下了基础。