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前言：脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床上较为严重的创伤。近年来,随着经济和社会的发展,因车祸、施工中高处坠落等高能量暴力引起的SCI呈逐年上升的趋势,SCI往往造成截瘫等严重后果,给社会和家庭带来沉重负担。SCI后继发出现水肿、出血、炎症反应、局部缺血等,特别是其中的水肿与受损组织中多种炎性介质的释放更可诱导一系列放大效应,造成神经损伤,导致严重后果。氨基胍(Aminoguanidine,AG)是一类小分子、水溶性化合物,常用于阻止或延缓糖尿病引起的相关肾脏损害,近年发现其作为选择性诱生型一氧化氮合酶(Induciblenitric oxide synthase,iNOS)抑制剂,在脑外伤及中风动物模型中能显著减轻脑水肿,缩小脑缺血面积,提高神经功能恢复程度,但其能否对SCI产生作用及其相关机制的研究目前尚未见报道。
目的：本研究旨在探讨氨基胍对大鼠急性脊髓损伤的作用,并研究其在减轻脊髓水肿和降低血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)通透性中的相关分子机制。观察大鼠急性脊髓损伤后给予不同剂量氨基胍后脊髓组织含水量的变化,了解不同剂量氨基胍在减轻脊髓水肿方面的效果。观察最佳剂量氨基胍作用前后SCI大鼠脊髓损伤段水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)、iNOS和紧密连接相关蛋白的分布和表达变化,以了解氨基胍对大鼠脊髓损伤保护作用的相关分子机制,本研究将为SCI的治疗寻找新的靶点。
材料与方法：
1.实验动物分组及压迫性脊髓损伤动物模型的建立:成年雄性Spmgur-Dawley(SD)大鼠,体重230-255g,随机分为四组。分别为:1、对照组(Control group);2、假手术组(Sham-operated group);3、SCI未治疗组(SCI group);4、SCI+氨基胍治疗组(SCI-AG group),此组按给药剂量分为以下3组,AG75 mg/kg组(SCI+AG-75 group)、AG150 mg/kg组(SCI+AG-150 group)和AG300 mg/kg组(SCI+AG-300 group)。每组内按时间点的不同又分为Oh,12h,24h和48h四个亚组。构建大鼠压迫性脊髓损伤模型:大鼠麻醉后以T12为中心沿背侧中线做纵行切口,切口长约3cm,暴露T11-T13节段棘突,去除T12棘突和全椎板,显露T12节段脊髓。用直径与之相等的扁圆形挤压头,在立体定位仪引导下,将挤压头以0.5mm/min速度于硬膜外向下挤压,向下挤压时间保持在5min,共向下挤压2.5mm,在1min内匀速缓慢抬起挤压棒,整个挤压过程共耗时6min。挤压完毕后,逐层缝合肌肉和皮肤。假手术组仅暴露硬膜。SCI+氨基胍治疗组于术后0.5h腹腔内注射不同剂量的溶于DMSO的AG(75mg/kg,150 mg/kg,300mg/kg),SCI未治疗组行脊髓损伤后每24小时给予等体积溶媒(5％DMSO以5 ml/kg的量溶入生理盐水中对大鼠进行腹腔内注射)。手术过程均在严格无菌条件下进行,术后大鼠饲养于完全清洁级环境中(辽宁省医学组织工程重点实验室),均给予生理盐水补液和青霉素预防感染。
2.应用干湿重法检测上述实验组大鼠脊髓组织含水量的变化,了解不同剂量氨基胍在减轻脊髓水肿方面的作用效果。
3.应用透射电镜和伊文思兰法(Evans blue,EB)观察最佳剂量AG作用后大鼠血脊髓屏障形态学及其通透性的变化。
4.RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测最佳剂量AG作用后大鼠脊髓损伤节段AQP4 mRNA及蛋白表达变化情况。
5.RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测最佳剂量AG作用后大鼠脊髓损伤段iNOS及紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、Claudin-5 mRNA及蛋白表达变化情况。
结果：
1.氨基胍对脊髓损伤大鼠脊髓组织含水量的影响:AG(150mg/kg)有最好的抗水肿特性(79.2±0.32％vs.81.8±0.46％,80.2±0.38％vs.82.1±0.49％and80.57±0.36％vs.82.42±0.51％,respectively,P＜0.05),而AG75 mg/kg组和AG300mg/kg组在脊髓损伤后的12h,24h和48h脊髓含水量较SCI组相比无明显统计学差异。表明AG抗水肿的最佳作用剂量为150mg/kg。
2.氨基胍对血脊髓屏障通透性的影响:伊文思兰法检测各组动物血-脊髓屏障通透性发现:AG(150mg/kg)处理后SCI大鼠的脊髓组织伊文思兰的含量较SCI组相比差异有统计学意义,作用剂量为150mg/kg的AG能明显降低SCI后血-脊髓屏障通透性。电镜结果显示:AG处理(150mg/kg)后,血管内皮细胞间紧密连接裂隙闭合,表明最佳作用剂量的AG能够降低血脊髓屏障的通透性。
3.氨基胍对SCI大鼠脊髓损伤段脊髓组织AQP4mRNA及其蛋白表达的影响:RT-PCR结果表明:在SCI后12h、24h和48h时,与假手术组相比,SCI组AQP4mRNA表达显著升高(p＜0.01),AG(150 mg/kg)作用后,表达显著降低(p＜0.05)。Western Blot结果表明:在SCI后12h AQP4蛋白表达在假手术组、SCI组和SCI+AG-150组表达无统计学差异,在SCI后24h和48h,SCI组AQP4蛋白表达显著高于假手术组(p＜0.01),而AG(150 mg/kg)能显著抑SUAQP4的表达(p＜0.05)。免疫组化结果表明:在SCI后48h,SCI+AG-150组的AQP4蛋白表达显著低于SCI组(p＜0.05)。
4.氨基胍对SCI大鼠脊髓损伤段脊髓组织iNOS及紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、Claudin-5 mRNA及其蛋白表达的影响:iNOS的Western Blot结果显示:在0 h时间点,对照组、假手术组、SCI组与SCI+AG-150组均未见iNOS的表达,在SCI后24h iNOS的表达最强,在SCI后24h和48h,与SCI组相比,SCI+AG-150组中iNOS的表达水平显著下调(p＜0.05),表明AG在SCI后24h和48h时可以显著降低iNOS的蛋白表达。紧密连接相关蛋白的免疫组化、RT-PCR和Western Blot结果显示:在SCI后24h,与SCI组相比,SCI+AG-150组中ZO-1、Claudin5与Occludin mRNA与蛋白水平显著上调(p＜0.05)。
结论：
1.作用剂量为150mg/kg的氨基胍能显著降低SCI大鼠脊髓组织含水量及血脊髓屏障通透性；
2.作用剂量为150mg/kg的氨基胍能降低SCI大鼠脊髓损伤组织AQP4mRNA及其蛋白表达水平；
3.作用剂量为150mg/kg的氨基胍能下调SCI大鼠脊髓损伤组织iNOS的蛋白表达水平；
4.作用剂量为150mg/kg的氨基胍能上调SCI大鼠脊髓损伤组织ZO-1、Claudin5与Occludin mRNA与蛋白表达水平。