论文部分内容阅读
实验目的:1.建立体外诱导小鼠原始生殖样细胞(primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化体系。2.鉴定体外诱导小鼠原始生殖细胞分化过程中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)表达量的变化。3.对小鼠原始生殖细胞诱导过程中关键长链非编码RNA进行功能预测。4.获取小鼠体内原始生殖细胞分化过程E5.5天外胚层细胞和E12.5天原始生殖细胞。实验方法:首先,我们模拟小鼠原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)体内分化生成过程,在体外经过两步诱导方法建立PGCLCs诱导体系。起始细胞我们使用小鼠胚胎干细胞(ESC),先经过两天贴壁培养诱导成为扁平状的外胚层样细胞(Epiblastlike cells,Epi LCs),然后取合适的细胞数量采用悬滴培养的方式继续诱导培养4-5天获得原始生殖样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)。我们使用PGCs分化特异性的标记基因Blimp1-GFP指示体外诱导前期阶段的成功,然后在需要收取分化样品的第4天用CD61和SSEA1来进行流式分选获取完整的PGCLCs群体。对各阶段获取的细胞样品,提取RNA反转成c DNA,用QPCR检测其各阶段标志性的基因,以证明体外原始生殖细胞诱导成功。总RNA中含有80%以上的r RNA,所以普通的转录组测序结果中含有大量的r RNA的数据,这就在很大程度上影响测序数据中的lnc RNA的数据含量,所以我们采用illumina公司的r RNA Removal kit,利用具有r RNA反向序列互补的DNA探针与r RNA进行杂交去除掉样品中的r RNA并且我们富集样品的时候并没有使用具有Oligo(d T)的磁珠,这样,不带有Poly A尾的RNA也可以被获取,因此我们相比于普通的转录组测序,可以获得更多的数量和种类的lnc RNA数据。对样品全基因转录组水平的测序,我们使用illumina平台的PE150双端测序,每个样品我们平均获得30M的数据量。我们使用Gencode对下机数据进行比对、分类。我们以FPKM的值指征其表达量,接着我们分析了诱导的两个阶段标志性基因的转录组水平的表达量,一方面验证我们数据的真实性,另外也可从侧面再次验证我们体外诱导原始生殖细胞是否成功。在判断基因在不同样品之间表达量的差别时,我们定义不同样品之间FC(fold change)≥2为差异显著。通过不同组别样品之间的比较,我们最终确定了在PGCLC中高表达,ESC中低表达的38种lnc RNA,我们对其中差异最大的前十种lnc RNA进行了QPCR的验证,最终验证发现了其中八种lnc RNA在PGCLC中的表达量确实高于其在ESC中的表达量,并且以lnc RNA-GM29156、GM-39397和GM-20005的表达差异最为显著。接着,我们用cat RAPID预测和这三种lnc RNA相互作用的蛋白,我们看到其相互作用蛋白都与配子发生相关,另外其参与了G蛋白偶联受体信号通路以及细胞表面受体信号通路。最后,针对体外诱导体系不同的时间点,我们同样获取了小鼠体内胚胎发育第5.5天(E5.5)外胚层细胞和第12.5天(E2.5)原始生殖细胞。为了操作简便和获取更加纯净的细胞群体,我们使用了Oct4-GFP的转基因C57小鼠。在E5.5天的外胚层细胞中会特异性的表达Oct4,因此在荧光显微镜下会看到明显的GFP荧光,我们使用粗细合适的玻璃针沿着GFP的边缘切取所需的外胚层细胞;在E12.5天的胚胎中,原始生殖细胞同样特异性表达Oct4,因此我们在体视显微镜下剥离中肾和生殖脊,然后进行流式分选GFP阳性的细胞群体,即我们需要的原始生殖细胞,之后我们用同样的方法对小鼠体内样品进行建库扩增。实验结果:1.建立了体外原始生殖样细胞的诱导体系。2.成功获取体外诱导原始生殖样细胞过程完整的lnc RNA的表达特点。3.验证了ESC和PGCLC表达量差异最为显著的十种lnc RNA,并预测了与其中前三种lnc RNA相互作用的蛋白,发现其这些lnc RNA相互作用蛋白主要与配子发生有关。4.获取了对应体外诱导阶段Epi LC和PGCLC的小鼠E5.5天外胚层细胞和E12.5天原始生殖细胞。