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目的:
EphBs 受体及ephrinBs 配体存在于成年的大脑及外周组织中，在各种病理过程、生理功能中具有重要作用。我们最近的研究发现，ephrinBs 作为致敏物质，通过激活外周ephrinBs / EphBs 信号系统引起外周敏感化和痛觉过敏，但是机制尚未明了。PI3K 涉及众多生理功能和病理过程的调节。研究证明PI3K 信号通路参与伤害性信息调制，介导伤害刺激引起的外周、中枢敏感化，如介导NGF/TrkA 和GDNF/Ret 信号激活引起的外周敏感化和痛觉过敏等。已有实验证实PI3K 参与调节EphBs 受体的激活。本研究目的是证明PI3K 是否参与介导外周ephrinBs / EphBs信号激活引起的痛行为。
方法:
1、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 后分别于10min、30min、1h、4h 及8h 时间点取足底注射部位皮肤, 用蛋白电泳检测外周注射ephrinB1-Fc 引起相应注射部位皮肤PI3K-p110γ及pAkt 表达变化的时间相。
2、足底注射ephrinB1-Fc 0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl，30min 后，用蛋白电泳检测外周注射ephrinB1-Fc 引起相应注射部位皮肤PI3K-p110γ及pAkt 表达变化的剂量依赖性。
3、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，15min 后，使用免疫荧光方法检测ephrinB1-Fc相应注射部位皮肤pAkt 表达的增加是否存在于外周伤害性感受器中；检测注射侧腰5 DRG pAkt 表达变化及pAkt 与NK1 受体共表达情况。
4、PI3K 抑制剂wortmannin 0.4μg/10μl 或LY294002 5μg/10μl 预处理，30min 后足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，ephrinB1-Fc 注射30min 后用蛋白电泳检测相应注射部位皮肤pAkt 表达变化，研究Akt 的激活是否通过PI3K 介导。
5、PI3K 抑制剂wortmannin 0.016、0.08、0.4μg/10μl 和LY294002 0.2、1、5μg/10μl预处理30min 或后处理1h，足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，检测预处理组ephrinB1-Fc 注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h 及48h 和后处理组ephrinB1-Fc注射后2h 的热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值，观察注射PI3K 抑制剂对ephrinB1-Fc 引起的痛行为的影响。
6、PI3K 抑制剂wortmannin 0.4μg/10μl 和LY294002 5μg/10μl 预处理30min 或后处理1h，检测ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 足底注射后1h(预处理组)或2h（后处理组）腰4、5 脊髓背角Fos 蛋白的表达。
7、PI3K 抑制剂wortmannin 0.016、0.08、0.4μg/10μl 或LY294002 0.2、1、5μg/10μl预处理30min，足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，30min 后使用蛋白电泳法检测相应注射部位皮肤pERK的表达，研究PI3K在ephrinB1-Fc 引起的注射部位皮肤ERK激活中的作用。
结果:
1、足底注射ephrinB1-Fc 后相应注射部位皮肤PI3K-p110γ表达呈时间依赖性、剂量依赖性增加，30min 达到最高峰，8h 恢复基础水平；pAkt 表达呈时间依赖性、剂量依赖性增加，10min 即可检测到明显增加，30min 到1h 间达到最高峰，持续至少8h。足底注射ephrinB1-Fc 15 min 后注射部位皮肤pAkt 的表达增加主要集中在伤害性感受器密集的表皮；注射侧腰5 DRG pAkt 表达增加，并且部分与NK1受体共表达。PI3K 抑制剂wortmannin 或LY294002 预处理能阻断ephrinB1-Fc 引起的足底皮肤pAkt 表达的增加。
2、PI3K 抑制剂wortmannin 或LY294002 预处理或后处理能防止或逆转ephrinB1-Fc足底注射引起的热、机械痛觉过敏，并且随剂量的增加抑制程度增加。3、PI3K 抑制剂wortmannin 或LY294002 预处理或后处理能防止或逆转ephrinB1-Fc足底注射引起的脊髓背角Fos 蛋白表达的增加。
4、PI3K 抑制剂wortmannin 或LY294002 预处理防止ephrinB1-Fc 足底注射引起的相应注射部位皮肤pERK 表达增加，并且呈剂量依赖性抑制。
结论:
PI3K 信号介导小鼠外周ephrinBs/EphBs 信号激活引起的痛行为，其作用可能部分通过ERK 介导。