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目的：探讨神经源性分化蛋白(neurogenicdifferentiation，NeuroD)在胰腺癌发生发展中的作用。
方法：1、应用组织芯片和免疫组化法研究NeuroD、增殖细胞核抗原(PCNA)、p53在127例胰腺癌中的表达情况，并光镜下观察胰腺癌神经组织浸润、神经周围淋巴细胞套、癌旁慢性胰腺炎、胰周淋巴结转移情况。分析NeuroD的表达与上述指标及性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及分化程度等的关系。
2、根据已公布的NeuroD基因序列(GenBankNo.NM_002500)，设计并合成4对miRNA的OligoDNA(分别简写为NeuroD-1、NeuroD-2、NeuroD-3、NeuroD-4)，退火形成双链DNA后，与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接，构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体，转化入感受态大肠杆菌DH5α；用Real-timePCR技术检测pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接，构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(packagingmix)共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定，利用绿色荧光蛋白作为报告基因，对病毒滴度和感染效率进行检测。
3、使用重组慢病毒Lenti-EGFP-NeuroD1-miR及阴性病毒感染PANC-1细胞，使用倒置荧光显微镜观察荧光，确定慢病毒感染目的细胞的MOI值；以GADPH为内参照，通过RT-PCR分析PANC-1细胞NeuroD基因mRNA表达水平的改变，确认干扰效果。采用CCK-8检测细胞的生长，流式细胞技术检测细胞的凋亡，Transwell检测迁移和侵袭等生物学行为的改变。裸鼠胰腺原位成瘤，观察稳定干扰NeuroD基因后，成瘤情况及侵袭能力的改变。
结果：1、NeuroD、PCNA和p53蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为64.57％(导管腺癌为63.01％)、57.48％和59.06％，与非癌组织相比，差异有统计学意义(P<0.01)。NeuroD蛋白的表达与PCNA、p53蛋白的表达和胰腺癌肿瘤神经浸润之间有统计学相关性(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及分化程度、瘤旁慢性胰腺炎、神经周围淋巴细胞套和淋巴结转移均等无统计学相关性。
2、成功构建针对靶基因的4个干扰质粒，测序结果表明，4对pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致，Real-timePCR检测显示以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD-1的沉默效应最佳。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株，酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致，病毒滴度达1.18×108ifu/ml。
3、使用RNAi重组慢病毒稳定感染PANC-1细胞，NeuroD的mRNA表达水平明显下调。与对照组相比较，RNAi重组慢病毒抑制NeuroD表达后，PANC-1细胞的生长受到抑制，细胞凋亡比例无显著提高，迁移和侵袭的细胞数目减少。稳定干扰NeuroD基因后，PANC-1细胞的裸鼠胰腺原位成瘤明显小于对照组，侵袭能力减弱。
结论：NeuroD蛋白在胰腺癌组织中呈高表达，可能参与了胰腺癌的发生和进展过程，并且与胰腺癌的增殖、p53信号通路和肿瘤神经浸润之间密切相关。成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR，为进一步应用RNA干扰技术研究NeuroD基因的相关功能奠定了基础。通过RNAi重组慢病毒Lenti-EGFP-NeuroD1-miR转染PANC-1细胞，可以稳定、高效、特异性地抑制NeuroD的表达。沉默NeuroD基因能显著抑制PANC-1细胞的体外和体内的增殖和侵袭能力。