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Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是固有免疫系统中一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),通过识别病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)启动一系列炎症反应,以清除入侵的病原体。病原体携带的多种PAMPs往往同时活化多种TLRs,由于不同的TLRs介导的下游信号通路,彼此之间相互独立,但又存在共同的汇聚点,由此,多种TLRs介导的信号之间就会发交互串扰,表现出相互叠加、相互协同或相互拮抗等不同的免疫效应。这对免疫调节具有特别的意义,然而,其背后的作用机制仍不完全清楚。一般情况下,TLRs所介导的炎症反应能够帮助机体清除病原体,维持免疫稳态。但是,如果TLRs被过度激活,就会导致自身免疫疾病的发生。前期研究中我们课题组发现的无免疫刺激性CpG-ODN c41分子,一段包含未甲基化Cp G结构的20bp寡聚核苷酸(Cp G-ODN)序列(5’-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3’),作为TLR9的拮抗剂,能够保护小鼠免受刺激性Cp G-ODN的攻击,表现出一定的抗炎作用。本研究利用TLR9拮抗剂Cp G-c41分子,在不激活TLR9信号通路的条件下,探究CpG-c41与其他TLRs间的交互作用,并利用Cp G-c41的无免疫刺激性,从一个全新的视角,探究其交互串扰机制,拓展我们对固有免疫中TLRs间免疫调节模式的理解。目的明确TLR9拮抗剂Cp G-c41分子对其他TLRs的交互影响,利用Cp G-c41的无免疫刺激性,明确交互影响发生的环节和作用机制。方法1.通过ELISA实验观察CpG-c41对TLR1/2激动剂Pam3CSK4、TLR2激动剂HKLM、TLR3激动剂poly(I:C)、TLR7/8激动剂ss RNA120和TLR9激动剂CpG-1826诱导的前炎症细胞因子TNF-α、IL-6释放的影响,明确Cp G-c41分子与其他TLRs间的交互作用。2.通过激光共聚焦显微镜,观察CpG-c41分子的吞噬入胞,掌握Cp G-c41的内化过程;利用免疫荧光技术探究Cp G-c41入胞后的转运过程;采用Cp G-c41双标荧光探针(3’Cy3作为荧光报告基团、5’BHQ-1作为荧光淬灭基团)研究CpG-c41在胞内的代谢过程。3.利用免疫荧光技术,观察比较CpG-c41和其他TLR激动剂内化竞争和受体竞争情况,探究CpG-c41交互串扰的具体作用机制。4.通过ELISA实验,探究CpG-c41是否影响激动剂诱导Raw264.7细胞释放前炎症细胞因子TNF-α,明确Cp G-c41对小鼠巨噬细胞的免疫应答能力的影响。结果1.Cp G-c41分子能够有效抑制TLR3、TLR7/8和TLR9(内膜型TLRs)诱导的前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的释放,但不影响TLR1和TLR2(胞膜型TLRs)诱导的TNF-α、IL-6的释放。2.3’Cy3-c41(3’端标记Cy3的Cp G-c41,红色标记)作用Raw264.7细胞5min后,胞内开始出现红色荧光,之后红色荧光分子逐渐增多,约11h后胞内的荧光强度达到峰值,随后趋于稳定,进入平台期,呈饱和状态。3.胞内的3’FAM-c41(3’端标记FAM的Cp G-c41,绿色标记)达饱和状态后,再加入3’Cy3-c41,发现胞内的绿色荧光逐渐减弱,红色荧光逐渐增强,即先前内化的3’FAM-c41出胞,而环境中的3’Cy3-c41继续入胞,说明Cp G-c41达平台期后处于一种动态平衡过程。4.不同荧光标记的Cp G-c41作用细胞后,对于Cy3标记,无论Cy3标记在CpG-c41的3’端,还是5’端,均能观察到胞内出现红色荧光;对于FAM标记,可以观察到3’FAM-c41和5’3’FAM-c41(5’,3’端同时标记FAM的Cp G-c41)入胞后的荧光分布,但是,观察不到5’FAM-c41的绿色荧光,而5’FAM-c41仍然能有效抑制CpG-1826释放前炎症因子TNF-α,说明5’FAM-c41依然入胞,只是通过磷酸二酯键连接的5’FAM发生了类似于核酸外切酶的作用,荧光基团在入胞的过程中丢失了。5.Cp G-c41双标荧光探针(同时标记荧光基团和淬灭基团)作用Raw264.7细胞40min后,胞内开始出现红色荧光分子,说明CpG-c41作用细胞40min后开始降解;Cp G-c41内化7min后定位于网格蛋白,15min与早期内体共定位,30min与溶酶体共定位,提示CpG-c41的内化转运需要网格蛋白的参与,首先转运到早期内体,30min后转运到溶酶体,40min后开始降解。6.Cp G-1826和CpG-c41都与TLR9存在共定位现象。与3’Cy3标记的CpG-1826组相比,CpG-c41加入后,Cp G-1826与TLR9无共定位现象。7.用FITC标记的Poly(I:C)作用Raw264.7细胞,发现5min后胞内出现绿色荧光分子,之后逐渐增多;用FITC标记的Poly(I:C)、3’Cy3-c41同时作用Raw264.7细胞,发现5min后胞内出现红色荧光分子3’Cy3-c41,6h后才观察到绿色荧光分子即FITC标记的Poly(I:C)。与单独的FITC标记的Poly(I:C)相比,Cp G-c41的加入使Poly(I:C)的入胞时间延迟了。8.ssRNA120经DOTAP包裹后,有效诱导HEK293/TLR7和HEK293/TLR8细胞释放炎症因子IL-8,CpG-c41的加入明显抑制了IL-8的释放;当ssRNA120和CpG-c41同时用DOTAP包裹后,CpG-c41同样能干扰ss RNA120对TLR7和TLR8的活化,说明干扰环节与胞膜资源争夺无关。9.免疫荧光实验表明,3’Cy3-c41与TLR7、TLR8存在明显的共定位现象。10.在只表达TLR3,TLR7,TLR8和TLR9,不表达CD14的HEK293细胞中,Cp G-c41的加入明显抑制上述相应激动剂诱导的NF-κB的活化。11.分别给予激动剂Poly(I:C)/ssRNA120/Cp G-1826初次刺激,Raw264.7细胞再次接受Poly(I:C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后,TNF-α的释放量较Medium组明显减少,即TLR激动剂的刺激会导致细胞免疫应答能力衰减;然而,当初次给予Medium或Cp G-c41处理,细胞再次接受Poly(I:C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后,与Medium组相比,Cp G-c41组正常释放TNF-α,即CpG-c41与Medium一样,不影响细胞免疫应答能力。结论1.Cp G-c41选择性干扰内膜型TLRs活化,对胞膜型TLRs没有影响。Cp G-c41发挥的多重免疫抑制效应与TLRs的分布有关。虽然胞膜型TLR1、TLR2与内膜型TLR7/8和TLR9均依赖MyD88信号通路,但CpG-c41选择性干扰内膜型TLRs,而对胞膜型TLRs无影响。另一方面,尽管TLR3与TLR7/8、TLR9下游信号通路不同,但Cp G-c41均能抑制这几种内膜型TLR的活化。由此说明,Cp G-c41的交互干扰效应与TLRs下游信号通路无关,其串扰发生在信号级联启动以前。2.Cp G-c41的内化转运代谢过程。3’Cy3-c41作用Raw264.7细胞5min后开始入胞,约11h后进入平台期,呈饱和状态。在Cp G-c41吞噬入胞的过程中,5’末端5’碳位点发挥了关键作用。Cp G-c41内化15min后转运到早期内体,30min后转运到溶酶体,40min左右开始降解。由此,Cp G-c41的干预环节发生在Cp G-c41内化入胞大致40min之前。Cp G-c41的内化是一种动态过程,即先前入胞的分子及降解产物不会在胞内滞留,提示Cp G-c41的干扰效应与内体饱和无关。3.Cp G-c41对内膜型TLRs的干扰机制针对不同的TLR,CpG-c41的干预方式也不相同,在入胞阶段,CpG-c41通过与TLR3激动剂Poly(I:C)竞争入胞干扰TLR3活化;在识别阶段,Cp G-c41通过与TLR7/8或TLR9竞争性结合发挥干扰作用。以往普遍认为TLR7/8特异性识别ss RNA,但本研究发现它们也能识别ssDNA,说明TLR7/8对配体识别的特异性是相对的,具有一定的兼容性。此外,CD14作为这四种内膜型TLRs一种共同的辅助受体,极有可能参与了交互干扰过程。本研究明确地排除了CD14参与Cp G-c41的多重免疫抑制效应。4.巨噬细胞接受刺激分子的作用后,免疫功能会耗竭,然而,对于非刺激性分子Cp G-c41,虽然经过了内化转运过程,但细胞的免疫功能并不受影响,提示Cp G-c41的无免疫刺激性和多重免疫抑制效应为自身免疫疾病的防治提供了新的策略。