生物催化阿维菌素生成4"位氧化阿维菌素的研究

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甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate),又称甲维盐,是一种低毒、无残留、对环境友好的新型生物农药。本研究对生物催化法制备甲维盐中间体4"位氧化阿维菌素进行了研究,初步建立了催化阿维菌素生成4"位氧化阿维菌素的工艺。首先,本文建立了以2,4-二硝基苯肼为显色剂的阿维菌素氧化活性菌比色法高通量筛选模型。实验结果表明该模型可以直观的定性检测4"位氧化阿维菌素的存在,并可以在440 nm处准确定量。本文研究了4"位氧化阿维菌素的快速液相检测方法,在以乙腈:水9:1(v/v)为流动相,流速2 mL/min,和柱温40℃条件下可以在8min内实现阿维菌素和其4"位氧化物进行完全分离,使检测速度提升了5倍。结合梯度洗脱,进一步实现了氧化产物的氧化位点的确认。通过高效筛选方法和产物检测技术,在土壤中筛选到了2株能够氧化阿维菌素4"-OH的菌株,其中菌株ZJB-14121具有较高的转化活性。通过形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列和系统发育树分析,最终该菌株被鉴定为天蓝黄链霉菌(Streptomyces coelicoflavus)。这是首次报道该种内能专一性氧化阿维菌素4"-OH的菌株。本文通过单因素和正交法对菌株S.coelicoflavus ZJB-14121的产酶培养基进行优化。得到了较佳发酵培养基配成分:糊精10 g/L,豆饼粉20 g/L,MnCl2·2H2O 15 mg/L,Cu Cl2·4H2O 15 mg/L,K2HPO4 0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L。最适培养条件:pH 7.0,28℃,装液量40 mL,接种量2.5%。在上述条件下培养4 d后,生物量达到4.64 g DCW/L,比酶活达到62.49 U/g DCW(Dry cell weight,细胞干重)。本文利用响应面优化法对菌株S.coelicoflavus ZJB-14121的转化反应条件进行了优化,并研究了菌体用量、菌体循环使用次数和菌体稳定性。结果表明,当转化反应条件为阿维菌素浓度0.53 g/L,金属盐离子浓度26.76 mg/L,搅拌速率195 rpm,温度28℃,pH 7.0和菌体用量为30 g/L(菌体湿重)时,比酶活达到最大值204.23 U/g DCW,比最初的比酶活提升了接近4倍。但是,该菌株的循环次数达到3次后就完全失活了。菌株稳定性实验结果表明菌体在4℃下保藏超过2天后开始快速失活,6天后完全失活。
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