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研究背景随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化,肥胖在全世界呈流行趋势。肥胖既是一种独立的疾病,又是糖尿病、脂肪肝、高血压等疾病的诱发因素。研究肥胖成因、控制和治疗肥胖症方法已刻不容缓。建立理想的肥胖症动物模型是研发相关药物及肥胖机制研究的基础。目前,常用的肥胖综合症动物模型基本上都是用啮齿类动物,具体方法有：高脂高糖高蛋白饮食法、电解法、谷氨酸钠、金硫葡萄糖法。另外还有肥胖大鼠和糖尿病等遗传性动物模型。美国科学家研究发现瘦素(leptin)及瘦素受体(OBR)功能异常、leptin抵抗是导致肥胖的主要原因之一。因此,leptin及其受体功能研究为肥胖症动物模型建立提供了思路。小型猪物质代谢形式、各器官形态和生理功能与人有很多相似性、体型小、易于操作,是制作代谢性疾病的理想模型动物。西藏小型猪是新型的实验动物,是体型最小、体重最轻的猪种之一,具有皮下脂肪沉积少的特点。因而西藏小型猪适宜用于制作肥胖综合症动物模型。研究目的和意义本研究克隆leptin及其受体基因,原核表达制备leptin成熟肽和OBR重组融合蛋白,为进一步建立肥胖症西藏小型猪模型和探寻预防控制肥胖方法提供材料和基础。传统的造模方法不能很好模拟人类肥胖的发生过程,且基本局限于啮齿类动物和极端的造模方法。目前,leptin及其受体重组融合蛋白免疫法主要应用于调控动物生产和育肥,而尚未见有利用瘦素及其受体重组融合蛋白免疫法建立肥胖症模型、预防控制肥胖的报道。因此利用瘦素、瘦素受体重组融合蛋白免疫法建立人类肥胖症西藏小型猪模型、探寻控制预防肥胖的方法具有特别意义。研究方法和结果本文研究的主要内容分三个部分。第一章西藏小型猪leptin及其受体基因的克隆根据西藏小型猪leptin基因序列(GenBank号：GQ240885.1)和猪OBR基因序列(GenBank号：AF092422.1)设计特异性引物。以西藏小型猪皮下脂肪组织的总RNA为模板,通过RT-PCR法扩增出leptin的cDNA片段。另以西藏小型猪肝脏组织的总RNA为模板,通过RT-PCR法扩增出OBR基因ECD(胞外区)、ICD(胞内区)的cDNA片段,然后利用重叠PCR法将OBR基因ECD、ICD连接起来,得到OBR基因的全cDNA序列。纯化后,leptin及OBR基因的cDNA片段连接到pMD18-T载体,转入E.coli.DH5α感受态细胞后进行PCR鉴定和测序分析,并将测序正确的转化菌进行保种。西藏小型猪OBR基因测序后与GenBank上报道的不同猪种及其它物种作同源性比较及亲缘进化树分析。结果表明,扩增获得的leptin基因序列长度为504bp, OBR基因序列长度为3498bp; leptin的cDNA测序结果经过DNA Star生物软件与Genbank(登陆号：GQ240885.1)上公布的序列进行对比分析,发现一处无义突变,可用于下一步表达载体的构建；西藏小型猪OBR基因与Genbank上报道的猪及其它物种相应的核苷酸序列作同源性比较分析,结果为：与野猪及广西巴马小型猪的亲缘性最高(99.6%),其次奶牛(91.1%),再次犬(90.0%),人类为88.3%。第二章西藏小型猪leptin成熟肽及其受体ECD片段原核表达载体的构建以leptin及OBR基因转化阳性菌为模板,另设计四对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物,利用套式PCR的方法分别扩增leptin成熟肽(64～504bp)和OBR基因ECD近信号肽区(322～969bp)、LBD区(1072～1641bp)及近跨膜区(1705～2364bp)相应的cDNA片段。扩增片段纯化后,连接到pMD18-T载体中。阳性重组质粒分别加入限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ进行定向酶切,将酶切获得的四个目的片段分别定向连接到pRSETA载体。构建好的四个表达载体转化到E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中,然后抽提重组质粒进行PCR、双酶切(BamHⅠ、HindⅢ)鉴定,对于鉴定为阳性的重组质粒送往上海英骏生物技术公司测序,以保证插入目的基因后重组质粒的阅读框架正确。结果显示,本实验成功克隆leptin成熟肽和OBR基因ECD近信号肽区、LBD及近跨膜区相应的cDNA片段。重组质粒鉴定结果显示PCR、双酶切得到的片段与leptin成熟肽和OBR基因ECD近信号肽区、LBD、近跨膜区cDNA序列片段及载体pRSETA的理论分子量相符。测序结果经过DNA Star生物软件分析,插入目的基因后重组质粒的阅读框架正确。说明目的基因的cDNA序列已经成功插入到pRSETA载体中,成功构建了leptin成熟肽和OBR基因ECD近信号肽区、LBD及近跨膜区的原核表达载体。第三章西藏小型猪leptin成熟肽及其受体ECD片段重组融合蛋白的表达、纯化Leptin成熟肽和OBR基因ECD近信号肽区、LBD及近跨膜区四个重组菌经1mol/L IPTG诱导表达4h后,结果显示分别表达出大小为18.0kDa、27.6kDa、23.5kDa和27.6kDa的融合蛋白,与理论值基本相符合。而pRSETA空菌体均无相应的表达带。说明构建的表达载体可在E.coli BL21(DE3)中可表达西藏小型猪leptin成熟肽和OBR基因ECD三个片段。Western blotting分析表明,用leptin猪抗兔多克隆抗体与leptin成熟肽融合蛋白进行反应,在17～26kDa之间有一条18kDa左右的目的条带,与理论值及SDS-PAGE电泳结果相符,证明leptin成熟肽成功表达；用His-Tag抗鼠的单克隆抗体与OBR基因ECD近跨膜区融合蛋白进行反应,在26～34kDa之间有一条27kDa左右的目的条带,与理论值及SDS-PAGE电泳结果相符,证明leptin成熟肽和OBR基因ECD近跨膜区融合蛋白成功表达。本研究还对leptin成熟肽以及OBR基因ECD近跨膜区的重组表达菌进行IPTG最优表达条件摸索(时间、IPTG浓度)。最优时间摸索：重组菌在LB液体培养基中37℃振摇培养,D600nm达到0.6以上后,加入0.5mmol/L IPTG分别诱导0、1、2、3、4、5、6、7h。重组菌IPTG诱导表达的最优IPTG浓度摸索：重组菌在LB液体培养基(含Amp100μg/ml)中37℃振摇培养,D600nm达到0.6以上后,加入IPTG浓度分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5mmol/L诱导4h。最优表达条件摸索结果显示,随着培养时间的延长,重组菌融合蛋白的表达量均逐渐增加,尤其在诱导3h以上,融合蛋白达到比较高的表达量,分别占总菌体蛋白的40.8%、20.3%；但IPTG浓度对重组蛋白的表达量均影响不大。Leptin成熟肽及OBR基因ECD近跨膜区的重组融合蛋白表达量较高,因而选取这两者进行大量表达和纯化。将重组菌进行大量表达,经变性后,可溶性部分在50%Ni-NTA树脂上过柱纯化,通过透析使蛋白质复性,得到较纯的leptin成熟肽及OBR基因ECD近跨膜区重组融合蛋白。结论综上所述,本研究克隆了leptin和OBR基因相应的cDNA片段,成功表达了leptin成熟肽和OBR基因ECD近信号肽区、LBD及近跨膜区重组融合蛋白。其中leptin成熟肽以及OBR基因ECD近跨膜区的重组融合蛋白表达量较高,因而选取这两者进行大量表达和纯化。以上工作为进行下一步的动物免疫实验、研究leptin及其受体基因的生物学功能、进一步用主动免疫方法建立人类肥胖症、糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢性疾病西藏小型猪动物模型,研究肥胖相关疾病发病机制、预防与控制肥胖提供方法和材料。