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研究背景:肿瘤血管发生依赖于血管内皮细胞的活化、增殖和迁徙。肿瘤起源的血管内皮细胞（Tumor-derived microvascular endothelial cells,TdMECs）不同于正常血管内皮细胞,因此分离和培养TdMECs对肿瘤血管发生机制和血管生成抑制的研究有重要的价值。Endoglin （CD105）是一种与内皮细胞增殖相关的细胞表面糖蛋白,它是转化生长因子（Transforming Growth Factor ,TGF-β）的受体,后者是调节细胞增殖和分化的多功能细胞因子。Endoglin对TGF-β的调节作用主要是抑制TGF-β的生物学效应,拮抗其对血管内皮细胞的抑制作用。Endoglin高表达于创伤、胚胎、炎症以及肿瘤组织的血管内皮细胞,在血管发生和血管壁的维持中有重要作用。目前,已有多项关于Endoglin在肿瘤血管发生中的研究,并用以评价Endoglin作为新的基因治疗靶点的价值。研究目的:利用自主构建的Endoglin基因siRNA的表达载体,转染并观察其对卵巢癌微血管内皮细胞（ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells ,ODMECs）的影响,探讨Endoglin基因沉默（RNA interference, RNAi）对ODMECs生长、增殖及内皮细胞管腔样结构（tubule-like structure,TLS）形成的抑制效应,深入了解Endoglin在抗肿瘤血管生成中的作用,为建立新的抗肿瘤治疗靶点奠定实验基础。研究方法:1. ODMECs分离、纯化和培养。选取卵巢上皮性恶性肿瘤组织进行原代卵巢癌微血管内皮细胞分离和培养,采用胰酶、胶原酶、dNaseI酶联合消化法获取ODMECs,并用连接有CD31抗体的免疫磁珠进行纯化。通过形态学、生化和表型特征对所获得的ODMECs进行鉴定;并检测其摄取乙酰化低密度脂蛋白（Acetylated-Low-Density Lipoprotein,DIL-acLDL）和结合凝集素Ⅰ（Ulex europaeus lectin I,UEA-Ⅰ）的能力,同时还观察到了其在体外培养中TLS的形成。2.选定Genbank号为NM000118的Endoglin mRNA序列,作为siRNA设计的模板。设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGenesil- 1中构建重组质粒,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切和序列测定。3.利用构建成功的Endoglin基因siRNA表达质粒pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2,通过脂质体介导转染ODMECs,并通过半定量RT - PCR观察转染后48小时重组质粒对Endoglin mRNA表达的影响;MTT法检测转染后ODMECs细胞增殖的变化;并且通过光镜观察转染pGenesil-ENG1后,ODMECs体外二维管腔样结构形成的变化。主要结果:1.采用胰酶、胶原酶、dNaseI酶联合消化法分离人卵巢癌微血管片段,利用MACS MicroBeads免疫磁珠内皮细胞分选系统纯化ODMECs,连续两次分选,所获细胞纯度高达99.65%,生长状态良好、可传代培养。应用光镜、免疫细胞化学、细胞流式、RT-PCR等技术对所获得的内皮细胞进行了鉴定,所获细胞呈现不均一性,传代后上述情况有所减轻;细胞FⅧ-RAg、CD31、CD34、CD105表达阳性;可摄取DIL-ac-LDL和结合UEA-I;在体外培养过程中,ODMECs在有细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）和无ECM的培养条件下可形成不同特点的TLS。2.根据Genbank中报道的Endoglin基因核苷酸序列（complementary DNA,cDNA）,设计出了两条阻断Endoglin基因表达的RNAi序列,通过酶切鉴定证实Endoglin真核表达载体pGenesil-ENG1、pGenesil-ENG2构建成功,插入片段测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。3.利用构建成功的Endoglin基因siRNA表达质粒pSilencer-ENG1、pSilencer-ENG2,通过脂质体介导成功转染ODMECs,其转染效率与国外文献报道相符。4.转染ODMECs细胞48h后,同阴性质粒pGenesil-H和未转染组相比,pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2均可引起靶基因表达水平的显著性下降。采用MTT法发现, Endoglin基因被抑制后ODMECs的生长出现明显的抑制（P<0.01）。此外,Endoglin基因被抑制后可明显减少ODMECs体外TLS的形成（P<0.01）,表现为管腔数目的减少和结构上的差异。结论上述实验结果表明,酶联合消化法和免疫磁珠细胞分选技术相结合能有效地获得高纯度ODMECs,且具可传代性,在体外培养可形成TLS结构。本研究所摸索出的ODMECs分离和纯化方法为建立其它实体瘤内皮细胞培养体系也积累了经验。有助于认识肿瘤环境诱导下的内皮细胞（Endothelial Cell,EC）异质性,而且为深入研究肿瘤血管生成和抗血管生成治疗提供了更为适用的实验材料和体外模型。本实验成功构建的Endoglin基因siRNA表达载体pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2,可下调Endoglin在卵巢癌微血管内皮细胞中的表达,抑制ODMECs的增殖和体外二维管腔样结构的形成。结果表明通过靶向肿瘤新生血管内皮表达的Endoglin,结合RNAi技术可作为一种有效的基因调控手段,有望成为抗肿瘤血管生成的有效策略,为抗卵巢癌血管生成的治疗摸索了新的有效基因靶点。