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流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)又称日本脑炎病毒，简称乙脑病毒，所引起的疾病简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的病毒性传染病，可以感染人类和多种动物，可以导致人的中枢神经系统疾病和猪的繁殖障碍，严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。对乙脑病毒和动物体内相应抗体的严密监测是防控该病的主要措施。本论文旨在通过基因工程手段，制备乙脑病毒的主要抗原蛋白，应用于乙脑血清学的检测；同时，建立一种能够快速、特异、灵敏检测JEV的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP），适合于简易实验室对田间样品的检测。
1.流行性乙型脑炎病毒E基因在大肠杆菌表达系统中的表达
根据GenBank上的JEV E蛋白基因序列，设计1对特异性引物，采用RT-PCR方法，扩增JEV E蛋白的基因片段，经酶切后将其克隆至大肠杆菌表达载体pBCX中，得到重组质粒pBCX-E。将重组质粒转化入表达菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组阳性菌pBCX-E，在终浓度lmmol/L IPTG诱导下进行表达，表达产物用SDS-PAGE检测。结果表明，JEV E基因获得成功表达，所得的融合蛋白mysB-E的相对分子量为88KDa，其最高表达量占菌体蛋白总量的33.2％。表达蛋白可溶性分析显示，mysB-E融合蛋白为可溶性表达，可溶性蛋白占菌体蛋白的23.5％。Western blotting结果表明，表达产物能与相应的阳性血清发生特异性反应。用50 ％Ni-NTA蛋白纯化树脂以非变性方法纯化融合蛋白pBCX-E，获得纯度较高的蛋白。纯化后融合蛋白的浓度为2.871 mg/mL。将纯化的重组蛋白作为抗原，用棋盘法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度后，对50份临床血清进行ELISA方法检测，同时与商品胶体金试试纸条检测进行比较，结果表明，胶体金试纸条检出阳性血清7份，ELISA方法检出阳性血清6份，阳性符合率为86％。表明表达的E蛋白可以作为抗原，应用于免疫学方法的检测。
2.流行性乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒表达系统中的表达
将JEV E蛋白基因插入至转座载体pFastBacTMHT A中，构建pFastBacrMHT A-E重组质粒，然后转化到E.coli DH5a感受态细胞中，以LB/AMP平板筛选阳性重组子，经酶切和PCR鉴定为阳性并测序正确后，再转化至E.coli DH 10Bac感受态细胞中，经抗性培养和蓝白斑筛选，筛选出白色菌落，提取重组Bacmid(命名为rBacmid- E)，经PCR鉴定为阳性后，转染Sf9昆虫细胞。在昆虫细胞内，重组Bacmid经复制，表达，装配，形成重组杆状病毒，并表达了JEV的E蛋白。经间接免疫荧光试验表明重组E蛋白具有良好的生物活性和免疫学活性。
3.流行性乙型脑病毒RT-LAMP技术检测方法的建立
针对JEV的NS3基因保守区，设计了一套包含六条引物的RT-LAMP引物组。在AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下扩增，最佳反应温度为63℃，最短反应时间为35min。运用白色沉淀观察法、SYBR Green I染色法、琼脂糖凝胶电泳、实时荧光法共四种方法判定扩增结果，其中前两种是肉眼可视观察。敏感度实验显示该方法比RT-PCR灵敏25倍。特异性分析显示该方法与猪的其它疾病病原无交叉反应。用建立的RT-LAMP方法对SA14-14-2株、SA103株、GD06株等3株不同的JEV毒株进行检测，检测结果均为阳性，与RT-PCR检测结果一致。初步表明该检测方法具有一定的适用性和应用前景。