【摘 要】
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Human cosavirus (HCoSV)属微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),为单股正链RNA病毒。至今,共分离出五个病毒种,分别为A,B,C,D,E (Human cosavirus A-E)。虽然HCoSV与临床症
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Human cosavirus (HCoSV)属微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),为单股正链RNA病毒。至今,共分离出五个病毒种,分别为A,B,C,D,E (Human cosavirus A-E)。虽然HCoSV与临床症状之间的关系尚不明确,但由于检出率相对较高,可能与其他肠道病毒发生混合感染或是疾病发生的诱导因素,对人类健康造成潜在的威胁。因此,建立一种敏感、特异的HCoSV的PCR检测方法具有重要意义。本文从HCoSV套式PCR检测方法的建立及初步应用、病毒基因组序列扩增及分析、VP3蛋白的表达纯化等方面进行了系统研究,结果如下:本研究根据GenBank上发表的HCoSV序列5’端非编码区(5’UTR)设计特异性引物,建立了HCoSV套式PCR检测方法,通过一系列反应条件的优化、特异性实验和敏感性实验,建立了一种快速、简洁、准确的套式PCR方法用于检测HCoSV。PCR反应目的片段为编码5’端非编码区(5’UTR)的RNA片段,大小为414bp。优化50ul反应体系中,退火温度为55℃,引物终浓度为1umol/L,MgCl2的浓度为1.25mmol/L、Taq酶的浓度为0.1 U/ul。与猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪肠道病毒9型(Enterovirus 9,EV9)、星状病毒(Human Astrovirus, HAstV)、博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)、塞弗病毒(Saffold virus, SAFV)等均无特异性反应。利用建立的套式PCR方法对上海地区248份新鲜采集的粪便样品(188份腹泻儿童及60份健康儿童)进行初步检测。结果显示:腹泻儿童中共有6份为阳性,阳性率为3.2%,健康儿童中有1份为阳性,其阳性率为1.6%,进化树及同源性分析发现7份阳性样品中共有5株为HCoSVA种(HCoSV-A),表明HCoSV-A可能为上海地区的流行毒株。实验表明,建立的套式PCR方法可用于临床粪便样品的检测,具有特异、敏感、准确、简洁的特点,该方法的建立为HCoSV感染的临床快速诊断提供了科学依据。根据HCoSV GenBank已知序列信息共设计10对引物,结合RT-PCR和Genome Walking等技术对其中一株病毒的全基因序列进行扩增,并对该株病毒的基因序列进行分析。结果显示:病毒的基因组长度约为7262nt,包括一个多聚蛋白为2125aa。将扩增出的VP3基因片段,克隆到原核表达载体pET-30a上,经酶切、测序鉴定后,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用终浓度l mmol?L-1 IPTG诱导,表达产物以包涵体形式存在。超声波裂解菌体后对包涵体进行溶解,再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,并对纯化的蛋白进行复性,全基因组序列的获得与VP3蛋白的表达为下一步蛋白功能基因组研究及ELISA检测方法的建立奠定了基础。
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