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烟酸脱氢酶可以将烟酸转化为6-羟基烟酸。6-羟基烟酸是一种很重要的化学中间体,在农药、医药、染料、材料等领域都有重要应用,具有广阔的应用前景和市场需求。
本论文建立了一种基于紫外显影法快速筛选烟酸脱氢酶产生菌的方法:在用96孔板培养菌后,将菌液点样到滤纸上,利用6-羟基烟酸在紫外照射下的显影特性,可以快速、方便的筛选出产烟酸脱氢酶的菌株。对筛选出的最高酶活菌株BKC4进行了研究,菌株为杆状,革兰氏染色呈阴性,通过16SrDNA序列分析鉴定为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida),其转化烟酸的产物通过液相色谱法鉴定为6-羟基烟酸。
通过单因素法优化了Pseudomonas putida BKC4的培养基成份和摇瓶培养条件,经过30h的摇瓶培养,酶活可达0.78U/mL;5L上罐发酵,培养时间大大缩短,在12h便达到最高酶活0.96U/mL。
对Pseudomonas putida BKC4的静息细胞催化反应条件进行了优化。最适催化条件为:温度37℃,pH6.5,烟酸10g/L,菌浓2mL/mL(发酵液:反应液),摇床转数200r/min,缓冲液浓度0.02M(pH6.5);对烟酸脱氢酶的酶学性质进行了初步研究,该酶在pH6.5,温度在30℃以下稳定性较好。收集发酵培养的菌体,进行静息细胞催化实验,36h时6-羟基烟酸的浓度可达到104g/L。
此外,用海藻酸钠包埋法对细胞进行了固定化研究,优化的固定化条件为:固定化时间24h、海藻酸钠浓度30g/L、氯化钙浓度20g/L;固定化细胞的热稳定性较游离细胞好,且在5批次连续催化中,单位体积菌液催化能力较游离细胞提高53%。
本论文的研究结果为产烟酸脱氢酶菌株提供了高效、快速的筛选方法,并筛选得到高酶活菌株,对其进行了培养和催化性能的研究,为生物法催化烟酸生产6-羟基烟酸的工业应用提供了技术基础。