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目的： 通过腹腔注射LPS构建经典的脓毒症模型，采用Western Blot、Real timeRT-PCR、流式细胞仪、激光共聚焦、免疫共沉淀、酶活性检测等方法和技术，阐明脓毒症大鼠脑组织氧化应激与线粒体结构和功能的损伤，探讨酪氨酸激酶Src和酪氨酸磷酸酶PTP1B在脓毒症诱导脑组织线粒体损伤中的变化及其影响线粒体功能的机制，进一步明确线粒体损伤的分子机制及关键调控因子，为脓毒症早期保护线粒体功能提供实验依据。 方法： 1.构建脓毒症大鼠模型 实验动物使用SPF级雄性Wistar大鼠，体重控制在250-300g，随机分为对照组和脓毒症组。给予脓毒症组大鼠腹腔注射10 mg/kg LPS溶液建立大鼠脓毒症模型，分别在相应时间点(6h，12h，24 h，48 h)处死大鼠，给予正常对照组大鼠腹腔注射0.9％生理盐水后立即处死（0h组），取脑组织-80℃保存备用。 2.一般项目检测 2.1 观察大鼠一般状态，采用动物多参数监护仪对大鼠心率、呼吸和体温进行检测和记录。 2.2 应用鲎试剂动态浊度定量测定法测定大鼠血浆LPS水平。 2.3 生存率观察记录 按随机数字表分为正常对照组（20只）和脓毒症组（20只），模型制作如前所述。观察记录两组大鼠从造模到术后7天的生存情况。 2.4 神经反射评估 分别对正常对照组大鼠（0h组），脓毒症组大鼠(6h、12h、24 h、48 h、3d、7d)处死前进行神经反射评估。神经反射评估评价大鼠角膜反射、耳廓反射、尾部反射、翻正反射和逃避反射改变。 3.大鼠脑组织形态学及线粒体超微结构观察 将正常对照组及脓毒症组大鼠在相应时间点麻醉后处死，选取大脑额叶皮质，部分切成约4mm厚度的小块后，浸于10％多聚甲醛固定过夜，行HE染色;部分切成约1 mm3大小置于2.5％戊二醛固定过夜，行透射电镜检测。 4.大鼠脑组织线粒体提取及蛋白浓度测定 使用线粒体/胞浆制备试剂盒通过差速离心法提取线粒体，超声破碎线粒体膜后，使用考马斯亮兰法/BCA法检测线粒体蛋白浓度。 5.大鼠脑组织线粒体膜电位及线粒体肿胀度检测 采用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)常规的绿色荧光(FITC-H)和红色荧光(PI-H)进行检测，以红色荧光强度/绿色荧光强度计算膜电位，比值可间接反映线粒体膜电位变化。以前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(sidescatter，SSC)平均荧光强度的比值(FSC/SSC)反应线粒体肿胀度。 6.大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物酶活性测定 提取的脑组织线粒体蛋白，根据考马斯亮兰法测定蛋白质浓度的结果，调整线粒体蛋白浓度至10μg/100μL，按照呼吸链复合物检测试剂盒说明进行操作。酶标仪上设置不同的检测波长，复合物Ⅰ使用340 nm和380 nm波长，复合物Ⅱ使用600 nm波长，复合物Ⅲ和Ⅳ使用550 nm波长，复合物Ⅴ使用340 nm波长，根据公式计算出酶活性。 7.大鼠脑组织线粒体活性氧(ROS)检测 按照活性氧检测试剂盒说明书进行操作。根据考马斯亮兰法测定蛋白质浓度后，将50μg线粒体蛋白与6-氯甲基-2，7-二氯二氢荧光素二乙酯在37℃避光反应15分钟后，通过流式细胞仪或酶标仪进行检测。 8.氧化应激因子检测 按照SOD、MDA、NO和NOS检测试剂盒说明书进行。通过考马斯亮蓝法检测线粒体蛋白浓度，按照说明书要求将线粒体蛋白加入反应液后反应，酶标仪上设置不同的检测波长读出OD值，根据公式计算出酶活性或浓度。 9.Western Blot检测 使用线粒体提取试剂盒提取大鼠脑组织线粒体蛋白，用BCA法测蛋白浓度。以线粒体蛋白VDAC作为内参。通过ECL显影，利用Kodak In-Vivo ImagineSystem F化学发光/活体成像分析系统采集图像后保存。Gel-Pro analyzer4.0软件比较各条带的灰度值，分析各蛋白在表达水平变化。 10.Real-time RT-PCR检测 使用Takara公司试剂盒及PCR仪进行RNA提取、逆转录及PCR反应。ABI7500荧光定量PCR仪上样，按照扩增标准程序进行。每个样本设置3个复孔，计算时取平均值，GAPDH作为内参基因，使用2-△△Ct计算目的蛋白相对表达量。 11.激光共聚焦检测 大鼠麻醉后取出脑组织，立即放入4％多聚甲醛中过夜，然后进行石蜡包埋切片。依次进行乙醇脱水、二甲苯脱蜡、抗原修复等，分别加入Src和PTP1B抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次后与抗兔IgG偶联的Alexa Fluor(R)488/5944℃孵育2小时，激光共聚焦显微镜下观察结果。 结果： 1.脓毒症模型的建立 脓毒症组大鼠腹腔注射10 mg/kg LPS后逐渐出现活动减少、精神反应差、嗜睡、拒食、立毛反应、腹泻等症状，伴随鼻周、唇周出血，同时体温、心率和呼吸均较正常组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），48小时达到峰值，7天下降至正常。脓毒症组大鼠血浆LPS水平均明显增高。脓毒症组大鼠6h神经反射评分明显下降，随后开始缓慢升高，第7天正常。脓毒症组大鼠与正常对照组生存率存在显著差异(P＜0.05)，24 h生存率为50％，7天生存率为45％。脓毒症组脑组织切片的HE染色也出现明显的损伤性改变。综合以上结果，提示脓毒症模型成功建立，且48 h是一个重要的时间点，需要对这段时期内的脓毒症大鼠进行深入研究。 2.脓毒症明显损伤脑组织线粒体结构和功能 透射电镜结果发现对照组大鼠脑组织线粒体形态大致正常，脓毒症组线粒体肿胀明显，线粒体嵴疏松溶解，少量线粒体出现“空泡样变”。脓毒症组的线粒体膜电位下降较对照组均有显著增加，呼吸链复合物酶Ⅰ-Ⅴ的活性也存在不同程度下降，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。脓毒症组ROS持续升高，差异具有统计学意义（F=501.361，P＜0.05），至48 h达到峰值（551.90±22.96），伴随SOD的明显下降，48 h降至最低（29.16±4.55），差异具有统计学意义(F=215.761，P＜0.05)。而MDA的变化与ROS变化一致，诱导脓毒症后，保持持续增长的趋势，差异具有统计学意义(F=215.761，P＜0.05)，48 h也达到了最高值（21.37±2.99）。线粒体NO生成和NOS活性在脓毒症组从6h开始明显升高，48 h达到峰值，较正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。脓毒症大鼠脑组织线粒体SOD活性与MMP呈强正相关关系;脓毒症大鼠脑组织线粒体ROS水平、MDA水平、TNOS活性、iNOS活性和NO浓度与MMP呈强负相关关系。 3.酪氨酸磷酸化水平下降引起的线粒体功能障碍与酪氨酸激酶Src和酪氨酸磷酸酶PTP1B相关 Western Blot检测、Real-time RT-PCR均发现酪氨酸磷酸酶PTP1B蛋白表达明显升高而酪氨酸激酶Src蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，激光共聚焦检测结果也证实了2种蛋白的变化趋势。与之相对应的是，诱导脓毒症后线粒体蛋白整体的酪氨酸磷酸化水平明显下降，其中脓毒症组氧化磷酸化复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的酪氨酸磷酸化水平较之对照组下降具有统计学意义(P＜0.05)，而氧化磷酸化复合物Ⅳ和Ⅴ的酪氨酸磷酸化水平未见有明显的变化（P＞0.05）。 脓毒症诱导的脑损伤中呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ的酶活性均明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。而活性Src蛋白可以增加复合物Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的活性，差异有统计学意义(P＜0.05)，活性PTP1B蛋白则可以降低复合物Ⅰ和Ⅲ的活性，差异有统计学意义(P＜0.05)，两者对复合物Ⅳ/Ⅴ的活性均没有影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时通过免疫共沉淀检测发现Src与复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ存在关联，而PTP1B与复合物Ⅰ/Ⅲ存在关联。 4.活性酪氨酸激酶Src和酪氨酸磷酸酶PTP1B影响线粒体ROS的生成和线粒体膜电位(MMP) 脓毒症组ROS生成出现了明显增加，而线粒体膜电位则出现显著的下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。ROS的生成和线粒体膜电位的改变也与活性Src和PTP1B蛋白的预处理相关，活性Src蛋白可以减少线粒体ROS的产生，提高线粒体膜电位，而活性PTP1B蛋白的作用正好相反。 结论： 1.腹腔注射10 mg/kg LPS构建模型符合脓毒症典型表现，提示造模成功。 2.脓毒症时脑组织线粒体结构和功能均明显受损，且损伤的高峰可能发生在48 h左右，氧化应激的明显增强可能是导致线粒体功能障碍的原因之一。 3.LPS诱导的脓毒症脑线粒体功能的下降可能与线粒体酪氨酸激酶Src和酪氨酸磷酸酶PTP1B调节的线粒体蛋白酪氨酸磷酸化水平下降有关。