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仔猪哺乳阶段的生长状况与后期的生长密切相关,而猪乳又是其赖以生存的营养来源。乳铁蛋白在猪常乳中的含量较低,但其具有抗菌,抗病毒,促进铁吸收等多种功能。提高猪乳中乳铁蛋白的含量对于仔猪的生长,抗逆性均有重要的作用。传统的选育方式较难明显的改善母乳品质,转基因技术则提供了一个良好的应用平台。传统的转基因技术一般是通过将表达载体以随机插入的方式导入受体细胞,其在表达量和安全性方面均不稳定。CRISPR/Cas9技术自从用于编辑外源DNA以来,目前已将其开发为具有多种功能的技术。利用CRISPR/Cas9对靶基因造成断裂的同时发生同源重组的概率比自然发生同源重组的概率提高了一千倍以上,因此CRISPR/Cas9将为转乳铁蛋白基因猪的制备提供帮助。但CRISPR/Cas9技术目前面临着效率较低,存在脱靶风险等问题,因此我们对于如何提高CRISPR/Cas9对靶基因的剪切和脱靶问题进行了初步的摸索。目前转基因依赖的技术还有体细胞核移植,虽然该技术已经应用了接近20年,但人们对其涉及的表观重编程机制还不是很明了,所以目前体细胞克隆技术还存在着效率低下,以及出生后代有异常表型等症状。为此我们利用同一窝出生的具有异常表型的克隆猪和表型正常的克隆猪进行了全基因组的甲基化测序,同时利用相同的样品对转录组测序,希望能从表观和基因表达方面找到影响克隆猪异常表型的原因。得到结果如下:(1)设计出了针对CSN1S1基因有效的sgRNA,发现不同的转染方式对靶基因的剪切具有显著的不同。其中脂质体转染效率相对较低,而核转方式可将剪切效率提高3-4倍。在没有同源模板的情况下,断裂的靶基因主要以缺失为主。(2)成功设计了同源重组载体,将猪自身的乳铁蛋白基因的CDS区通过2A连接在了CSN1S1基因同源臂之后。载体共转染成纤维细胞后经过筛选得到了在CSN1S1基因后定点插入的转乳铁蛋白基因的成纤维细胞,为体细胞克隆提供素材。同时我们验证了所使用的2A具有100%的自剪切功能,表达出来的重组乳铁蛋白将不会影响α-S1酪蛋白的功能。(3)构建了带有荧光标记的Cas9表达载体,利用流式细胞术筛选,大大提高了富集细胞的剪切效率,基本上达到了基因的完全敲除,为基因功能的研究提供了工具。我们利用该载体通过G418的筛选获得了稳转Cas9基因的PK15细胞株,为以后构建sgRNA文库提供了方便。同时针对一个基因设计多个sgRNA共同转染,通过对靶基因的Western blot检测发现蛋白表达相对单个sgRNA的效率显著降低。(4)针对截短型的sgRNA脱靶情况进行了分析,发现随着sgRNA的截短(17-19bp),脱靶的风险会显著增加,同时意味着可选择的sgRNA的数量变少。针对选择的截短型sgRNA脱靶验证发现,在某些位点截短型的sgRNA确实降低了脱靶,但有些位点的脱靶却并没有降低。盲目选择截短的sgRNA会有靶向效率降低,脱靶效率增加的风险。(5)针对克隆猪的DNA甲基化测序发现,异常克隆猪在全基因组范围内去甲基化位点要多余高甲基化位点,但在CpG岛内,异常克隆猪的甲基化水平却高于正常克隆猪。通过对差异甲基化位点的注释,发现同一个基因内可以同时有低甲基化和高甲基化的现象。七种重复序列的甲基化水平发生变化。对转录组测序共发现了1700多个差异表达基因,其中1500多个基因是上调表达。243个基因的甲基化水平和表达水平均发生了变化。MAPK信号通路是差异表达基因主要富集的通路之一。(6)通过对甲基化数据和转录组数据的联合分析,发现DNA甲基化和基因表达在转录起始位点附近呈现负相关关系。正常克隆猪基因区的甲基化与基因表达呈现正相关关系,而异常克隆猪在基因区的DNA甲基化和基因表达没有明显的正相关关系,提示这里的异常调控可能影响到了克隆猪的异常发育。