论文部分内容阅读
植物内生真菌是高度多样性的微生物类群,其次级代谢产物丰富多样,具有合成与宿主植物相同或相似化学成分的能力。罗汉果(Siraitia grosvenori)是我国传统的药食两用植物,罗汉果果实中的皂甙、多糖、黄酮等都具有很好的抗氧化活性。这表明罗汉果内生真菌可能产生具有抗氧化活性的代谢产物,可能是抗氧化活性物质的重要来源。本论文采用活性追踪的方法,对桂林龙胜县罗汉果内生真菌及其代谢产物进行研究。内容包括:新鲜罗汉果内生真菌的分离;抗氧化活性研究;活性成分的追踪与分离。研究主要内容和结果分析:1、罗汉果内生真菌的分离与化学成分预试验采用植物组织块切割法,从新鲜的罗汉果中分离出15株内生真菌,挑选10株优势菌株进行菌落形态观察。将菌株接种于发酵培养基中26℃、170 r/min摇床发酵6 d,发酵结束后,减压抽滤分离发酵液与菌丝体。发酵液浓缩至浸膏,菌丝体50℃烘干,粉碎,再分别用石油醚、乙醇和水溶液提取,提取物进行化学成分预试验,初步了解菌株代谢产物所含的化学成分。实验结果可知,大部分内生真菌含有多糖、黄酮、蒽醌、有机酸等化学成分。2、活性菌株的筛选与鉴定采用清除1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、清除羟自由基(·OH)和总还原力3种方法对10株内生真菌的发酵产物进行抗氧化活性的筛选。结果表明,10株内生真菌的发酵产物具有较强的总还原力和对DPPH·、·OH表现出良好的清除力,最后筛选出一株发酵液和菌丝体都具有较强抗氧化能力的菌株F-5。当菌株F-5发酵产物浓度为1 mg/m L时,发酵液对DPPH·和·OH清除率分别为74.09%和64.74%,菌丝体的清除率分别为73.56%和55.32%,小于同浓度Vc对DPPH·清除率(99.36%)和对·OH清除率(95.77%)。发酵液与菌丝体总还原力分别为1.547和1.241,大于同浓度Vc的总还原力(1.145),数据表明F-5菌株具有较强的抗氧化活性。因此,选取对自由基清除率最高的菌株F-5进行分子生物学鉴定。将菌株F-5在PDA培养基上划线,26℃培养4-5 d,菌落生长较快,质地疏松,刚开始生长的菌丝白色带黄色,随后变为淡绿色或者褐色。提取菌株F-5的DNA,采用通用引物进行18s r DNA基因PCR扩增。测定结果显示,该序列长度为576 bp。将序列通过BLAST和Gen Bank已有的序列进行比对,并构建系统发育树,可知该菌株与Aspergillus oryzae有99%的同源性,结合菌落形态观察,得出该菌株为米曲霉(spergillus oryzae)。3、菌株发酵条件优化采用单因素试验,研究碳源、氮源、发酵时间对菌株抗氧化活性的影响,并在单因素实验结果基础上,选择葡萄糖、蛋白胨、氯化钠和初始p H值四个因素设计正交实验,以发酵液对DPPH·和·OH清除率为实验指标,进一步优化菌株抗氧化活性条件。结果表明,最佳氮源为蛋白胨,最佳碳源为葡萄糖,最佳发酵时间为6 d,最佳初始p H值为6~7,菌株对自由基清除的影响因素依次为:氯化钠>葡萄糖>蛋白胨>初始p H值。菌株F-5最佳优化条件为A4B1C1D2,即葡萄糖35 g,蛋白胨2.0 g,Na Cl 0.5 g,初始p H值为6~7。此条件下对菌株F-5进行发酵验证,发现其对DPPH·和·OH清除率分别为97.53%和84.43%。说明菌株F-5发酵产生抗氧化活性成分的最佳条件为A4B1C1D2。4、抗氧化活性部位的筛选采用菌株F-5优化的条件进行发酵,发酵结束后,得到的发酵液采用液-液萃取法用石油醚、氯仿、乙酸乙酯三种有机溶剂按极性由小到大对发酵原液进行萃取,回收有机溶剂,获得原液、3个萃取相和水相五种部分。采用3种方法测定5种浸膏的抗氧化能力并对其进行化学成分预试验,追踪抗氧化活性部位与成分。由结果可知,当样品浓度为1mg/m L时,乙酸乙酯相和水相对DPPH·清除率分别为76.88%、73.53%;对·OH清除率为62.21%、61.98%;总还原力为0.736、0.615。清除自由基能力高于其余三个萃取相,表明罗汉果内生真菌具有一定的抗氧化活性,其活性部位主要集中在乙酸乙酯相和水相。5、抗氧化活性部位的纯化及活性成分的追踪和结构鉴定对原液浓缩时,有物质析出,为化合物A。再采用大孔吸附树脂AB-8对活性部位水相和乙酸乙酯相进行初步分离,分别用蒸馏水和80%乙醇洗脱。当水相的水洗脱液浓度相当于500 mg/m L原液重时,水相的水洗脱液具有较强的抗氧化活性,对DPPH·和·OH清除率分别为80.85%和66.01%,小于Vc(1 mg/m L)的清除率分别为99.36%和95.77%;而乙酸乙酯相的水洗脱液对DPPH·和·OH清除率只有51.79%和41.56%。水相的80%乙醇洗脱液对DPPH·和·OH清除率分别为70.11%和46.25%;乙酸乙酯相的80%乙醇洗脱液对DPPH·清除率和·OH清除率分别为38.79%和23.42%。从中择优选取对DPPH·和·OH清除率最好的水相水洗脱液做后续实验研究。用80%的乙醇对水相的水洗脱液进行醇沉反应,沉淀物为样1,醇浓缩为样2,抗氧化活性测定结果表明样1>样2。当样1的浓度相当于500 mg/m L原液重时,对DPPH·清除率为90.60%,对·OH清除率为79.69%,样1的清除率接近于Vc(1 mg/m L),它对DPPH·清除率为99.36%,对·OH清除率为95.77%。样2对DPPH·清除率和对·OH清除率分别为38.89%和23.42%。因此,选取样1继续追踪抗氧化活性成分。用无水乙醇对样1进行醇洗去单糖时,浓缩醇洗液得到化合物B,不溶物为粗多糖。粗多糖经过葡聚糖凝胶继续分离,得到化合物C。对化合物A、B、C的抗氧化能力测定得出,当化合物A、B、C的浓度分别为500 mg/m L时,对DPPH·清除率分别为46.29%、12.36%、96.35%;对·OH清除率分别为35.48%、3.18%、92.85%;总还原力分别为0.496、0.009、1.23。其中多糖类的化合物C抗氧化能力最强,化合物B次之,化合物A最低。采用安捷伦紫外光谱扫描(UV)、400MHz超导核磁共振谱仪、红外光谱仪等结构鉴定方法对化合物A、B、C进行测定。结果发现化合物A、B的1H NMR和13CNMR测定结果分别与文献报道的甘露糖、麦芽糖显示的1H NMR、13CNMR谱数据相一致,说明化合物A为甘露糖,化合物B为麦芽糖。化合物C的紫外光谱扫描(UV)结果显示在260 nm和280 nm均无出现峰值,表明不含有核酸和蛋白,红外光谱(IR)显示,化合物C含有四个多糖类物质的特征吸收峰,说明化合物C为多糖类物质。本研究获得一个来自于罗汉果内生真菌——米曲霉所产的具有较强抗氧化活性的成分多糖类化合物,本研究可为进一步抗氧化剂的开发提供研究基础。