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课题组前期研究了饲用不同硒源（亚硒酸钠、酵母硒、甲硒氨酸）及其水平对肉种母鸡及其后代生产性能的影响,结果表明:肉种鸡饲喂甲硒氨酸（SM）和酵母硒（SY）能显著提高肉种鸡产蛋率、孵化率及种蛋的硒含量,总体效果明显优于亚硒酸钠（SS）,且SM同比SS降低了种蛋孵化后期死胚率,其中SM最佳剂量为0.15 mg Se/kg。为此,本论文在建立鸡胚和肝细胞急性氧化应激损伤模型的基础上,比较SM和SS两种硒源对鸡肝细胞氧化应激损伤的保护作用,两者差异化调控肝细胞氧化应激相关Keap1-Nrf2-ARE信号通路的作用靶点以及对抗氧化硒蛋白基因表达效率的影响,深入探讨了 SM上述营养调控作用的分子机制,旨在为其开发和应用提供理论依据。试验一:母源甲硒氨酸对鸡胚急性氧化损伤的保护作用1.1建立鸡胚急性氧化应激模型在种蛋孵化后期第17 d注射0、10、25、50、75μg敌草快（Diquat,DIQ）,24 h后引起鸡胚表观现象明显变化:尿囊绒毛膜出现发红、充血等症状。随着Diquat注射剂量加大,鸡胚死亡数上升,两者间呈显著正相关。其中,25 μg Diquat即可导致鸡胚死亡,检测肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、氧化产物丙二醛（MDA）含量显著上升。由此表明,该实验成功建立了 Diquat诱导的鸡胚急性氧化应激损伤模型,Diquat适宜注射剂量为25 μg。1.2母源甲硒氨酸对敌草快诱导急性氧化应激鸡胚的保护作用应用上述构建的鸡胚急性氧化应激模型,本试验采用3×2因子完全随机设计,即3种硒源:基础日粮（硒水平0.04 mg/kg）、基础日粮+0.15 mg Se/kg SS、基础日粮+0.15 mg Se/kg SM;2种Diquat水平:0和25 μg。试验选用40周龄梅黄4号种母鸡180只,随机分为三组,试验期12周（预试验4周,正式试验8周）。各硒源种蛋于孵化期第17 d随机分为2组,分别进行无菌水或Diquat注射,分为CON（基础日粮+无菌水注射）、SS（SS+无菌水注射）、SM（SM+无菌水注射）、CON-DIQ（基础日粮+Diquat 注射）、SS-DIQ（SS+Diquat 注射）、SM-DIQ（SM+Diquat注射）6组,每组8个重复,每个重复20枚。孵化第18d解剖取样分析,第21 d出雏期统计死胚率,获得主要结果如下:1)Diquat注射显著提高了鸡胚死亡率和肝细胞凋亡率,降低了肝脏总抗氧化能力（T-AOC）,增高了自由基（NO）及其氧化产物（蛋白质羰基）水平;组织切片H E染色显微观察显示肝细胞出现空泡化现象;电镜观察显示肝细胞电子密度降低、内质网核糖体脱落、线粒体内脊肿胀或消失现象。2)母源日粮加硒处理显著降低了鸡胚死亡率和肝细胞凋亡率,提高了鸡胚肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶（GPx,TrxR,CAT,γ-GCS）和氧化酶（MPO,XOD,MAO）及二相解毒酶（HO-1、NQO1）活性,降低了自由基（ROS,NO）及其氧化产物（蛋白质羰基,MDA）水平,升高细胞线粒体膜电位,增高抗凋亡蛋白Bcl-2而减低凋亡蛋白Caspase-3水平。由此表明,母源硒明显缓解了种蛋孵化后期Diquat诱导的急性氧化应激反应而降低鸡胚死亡率,SM总体效果明显强于SS。试验二:母源甲硒氨酸对鸡胚肝脏Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在试验一的基础上,进一步探究了母源SM对鸡胚肝脏Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响,实验室分析结果表明:1)母源硒处理显著上调了肝细胞Nrf2 mRNA丰度、Nrf2蛋白表达量及其磷酸化水平,并促进Nrf2蛋白核转位;2)母源SM在一定程度上下调了鸡胚肝细胞20S蛋白酶体活性;增高了主要抗氧化硒酶（GPx1,TrxR）、二相解毒酶（NQO1,HQ1）mRNA丰度及其蛋白表达量。SM的上述总体效果明显优于SS。由此说明,SM能激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强Nrf2基因表达及其蛋白磷酸化,同时抑制Nrf2蛋白泛素化降解,进而提高下游基因抗氧化和二相解毒酶的基因表达。试验三:甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的的保护效果及Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在体内试验的基础上,通过鸡肝LMH细胞体外培养试验,进一步验证SM对急性氧化应激损伤的保护效果及Keap 1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用。3.1建立鸡肝LMH细胞急性氧化应激模型1)通过H2O2处理LMH细胞系24 h的实验结果表明:在0-1000μmol/L浓度内,随着H2O2浓度的升高,LMH细胞上清液LDH活性渐增,而细胞存活率渐降,两者呈显著的相关性。其中,1000 μmol/LH2O2处理组细胞存活率在50%左右,可满足后续实验需求。2)在10-100ng/ml浓度范围内,SS或SM同时处理24 h显著提高了 LMH细胞存活率和GPx活性;1000 ng/ml SS处理产生细胞毒性导致细胞死亡,而SM没有这一现象。其中,100 ng/ml硒添加具有最优效果,可满足后续实验要求。由此成功建立了 H2O2诱导的鸡肝LMH细胞急性氧化应激模型,H2O2适宜处理浓度为1000 μmol/ml,硒处理的最佳剂量为100ng/ml。3.2甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的的保护效果在实验3.1的基础上,深入研究结果表明:1)H2O2处理增加了 LMH细胞ROS、NO和MDA含量,增强了 Capase-3活性,诱导细胞凋亡,提高了 LMH细胞死亡率。2)SM处理能提高LMH细胞T-SOD活性及T-AOC水平,抑制ROS、NO和MDA的生成,升高细胞线粒体膜电位,降低Caspase-3水平和细胞死亡率。由此证实,SM明显缓解了由H2O2诱导的鸡肝LMH细胞急性氧化应激反应,SM总体效果明显强于SS。3.3甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在试验3.2的基础上,同时探究了 SM对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用。试验结果表明:SM处理能显著上调LMH细胞Nrf2 mRNA丰度,下调细胞20S蛋白酶体活性;增高GPx、TrxR、HO-1 mRNA丰度,以及GPx活性和TrxR含量。上述总体效果明显优于SS。由此进一步证实,SM能激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,抑制Nrf2蛋白泛素化降解,调控抗氧化硒酶和二相解毒酶的基因表达,从而达到缓解氧化应激的作用。3.4甲硒氨酸对LMH细胞抗氧化硒酶基因表达效率的影响在实验3.1和3.3的基础上,进一步研究结果表明:硒处理显著提高了 LMH细胞Keap2-Nrf2-ARE信号通路下游主要含硒酶（GPx、TrxR、SEPP）mRNA稳定性和蛋白合成速率,SM总体效果强于SS。由此提示,SM高效增强了主要抗氧化含硒酶的基因表达效率。综上所述,母源SM能通过高效激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强Nrf2基因表达及其蛋白磷酸化水平,同时抑制Nrf2蛋白泛素化降解,进而促进下游主要抗氧化含硒酶和二相解毒酶的基因表达,增强鸡胚抗氧化功能而缓解鸡胚急性氧化应激损伤,达到降低种蛋孵化后期死胚率的作用效果。