DNA聚合酶X家族新成员—DNA聚合酶λ2功能的初步研究

• 作 者: 谷福
• 机 构: 复旦大学
• 出 处: 复旦大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: DNA聚合酶λ2 蛋白纯化 酶活性 酵母双杂交 肝肿瘤

本研究发现并克隆了一个肝脏特异的人类DNA聚合酶基因，是POLλ的一个剪接体，命名为POLλ2。该基因的eDNA长2206bp，包含一个1452bp的开放阅读框，编码482个氨基酸，位于人10号染色体长臂24区，长约7．9kb，包含8个外显子和7个内含子。生物信息学分析表明，POL入2蛋白和DNA聚合酶X家族成员高度同源，并含有这个家族特有结构域POLx，因此是一个DNA聚合酶X家族的新成员。该基因核苷酸序列和相应蛋白氨基酸序列已提交至GenBank，登录号为AY302442。
亚细胞定位实验证实，POL入2蛋白定位于细胞核；在人16种组织中表达谱实验表明，该基因在肝组织中特异性高表达，在其他组织中不表达或低表达；癌和癌旁表达差异实验表明；和正常肝组织和癌旁组织相比，在十六个癌组织的样本中有80％样本的POLλ的表达上调，导致POLλ2和POLλ的mRNA分子的比例异常，可能和肝癌的病理过程有关。
大肠杆菌重组表达融合蛋白POL入2时，通过菌株筛选，获得能高表达POL入2的宿主菌；通过优化条件，找到一种可以高效地使POL入2包涵体变为可溶蛋白的方法，对于其他蛋白表达时，减少包涵体蛋白的产生，增加可溶性，具有参考作用。
纯化了POL入2蛋白，经过同位素Q．p32．dCTP掺入实验，证实了POLλ2具有DNA聚合酶活性；在探索纯化原核表达的融合蛋白POL入2时，建立了一种新的高效纯化方法一脱氧核糖核酸酶纯化法，为研究DNA结合蛋白的纯化提供了新思路。
以POLλ2为诱饵蛋白，利用酵母双杂交(MATCHMAKERGAL4Two-HybridSystem3)筛选了人胎肝和睾丸eDNA文库，获得了阳性克隆CAPER／coactivatorofactivatingprotein-1(AP-1)andestrogenreceptors(ERs)。