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褐藻胶是一种人体不可缺少的水溶性膳食纤维,有利于减少人体对蛋白质和脂肪的吸收,表现出降低血脂,预防肥胖、高血脂、以及其他心脑血管疾病的功能。另外,褐藻胶还具有抗肿瘤、预防结肠癌、保护肠道健康、排除体内重金属离子的功能。褐藻胶因其良好的理化性质被广泛应用于生物、食品、化妆品、纺织、印染等领域。虽然褐藻胶广泛存在于巨藻、海带、昆布、鹿角菜、墨角藻和马尾藻等上百种褐藻的细胞壁中,但传统褐藻胶生产方式即从褐藻中提取褐藻胶的生产方式不可再生,褐藻的养殖环境容易受到气候和季节的影响,不同批次褐藻胶的组成与化学结构差异大,且生产过程中产生的碱性或有机废水容易造成环境污染。这些因素限制了褐藻胶以及褐藻胶寡糖的开发和利用。微生物生产褐藻胶具有生产周期短;生产不受季节、地域和病虫害条件的限制;褐藻胶易与菌体分离;生产过程中环境污染少;容易对褐藻胶的性状进行控制等优点。虽然目前生产成本较高,但具有降低成本的潜力。目前,微生物来源褐藻胶的研究主要集中在棕色固氮菌和铜绿假单胞菌。由于棕色固氮菌发酵生产褐藻胶的条件要求较高、微生物遗传操作较难、产量较低,更多的科学家将目光集中到了利用铜绿假单胞菌产褐藻胶上。本文所述研究,采用海洋转座子突变文库筛选方法,对铜绿假单胞菌进行基因改造,以期铜绿假单胞菌基因组中调控褐藻胶产生基因得以过表达,从而获得能够发酵高产褐藻胶的菌株,并实现褐藻胶生产。其次采用体外发酵模型模拟肠道环境,比较研究褐藻来源褐藻胶与细菌来源褐藻胶被人体降解的过程、对肠道内短链脂肪酸产量的改变、以及对人体肠道菌群结构的影响。最后比较研究人体肠道菌群对不同来源褐藻胶的降解情况,从降解菌群中分离培养降解褐藻来源褐藻胶与细菌来源褐藻胶的菌株,并进行测序鉴定。具体实验结果如下:1.转座子突变文库筛选获得了一株褐藻胶高产菌株PFAC-PA01。反向PCR测序发现,突变株褐藻胶的生产可能是由于转座子PFAC上的庆大霉素启动子插入到了铜绿假单胞菌algU基因的上游,导致algU基因过表达所致。2.利用获得的铜绿假单胞菌进行褐藻胶的发酵生产。高效离子液相检测结果显示所获得的多糖由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸组成,属于褐藻胶多糖。其产量为每0D600细菌生产约32μg褐藻胶。3.利用人体肠道菌群体外模拟发酵模型研究两种来源褐藻胶与肠道菌群间的相互作用。薄层色谱实验结果表明志愿者粪便肠道菌群对两种来源褐藻胶的降解情况相似。这两种来源的褐藻胶在发酵24h后均被大部分志愿者降解利用,72h后被所有志愿者降解利用。气相色谱法分析短链脂肪酸产量变化结果显示,两种来源褐藻胶均使得短链脂肪酸产量增加。PCR-DGGE结果和基因组测序分析表明,这两种来源褐藻胶对肠道菌群具有相似的调控作用。这两种多糖发酵后的菌群结构相似性均大于9 90%,分别为 99.2%、91.4%、95.4%、98.95%、97.1%。4.对两种来源褐藻胶降解菌的分离鉴定。成功分离获得了可以降解这两种褐藻胶的菌,测序分析结果显示这两株细菌均为拟杆菌,且存在相同的褐藻胶裂解酶基因,能够互为降解。