论文部分内容阅读
背景和目的 婴儿痉挛症，又称West综合征，是一类年龄依赖的难治性癫痫综合征，也是婴儿时期最常见的癫痫脑病之一，临床以成串的痉挛发作为其特征性表现，常伴有发作间期脑电图高峰失律及精神运动发育落后或倒退。其治疗困难，多数患儿预后不良，可转变为其他类型难治性癫痫或遗留严重的智力运动发育落后。 尽管既往文献报道，临床中已有多种治疗药物及方案的应用，目前最常用的治疗方法仍是促肾上腺皮质激素（ACTH），口服皮质类固醇（OCS）和氨己烯酸。其中氨己烯酸为患有结节性硬化症的婴儿痉挛症患儿的首选药物，但该药尚未进入我国市场，且可引起永久性管状视野缺损等不良反应。ACTH为我国及欧美国家治疗病因不明的婴儿痉挛症的首选药物，但药源短缺限制了其临床应用。近年来陆续有报道甲泼尼龙治疗婴儿痉挛症取得较好疗效，但关于其是否与ACTH疗效相当，是否可以替代ACTH作为婴儿痉挛症治疗的首选药物仍存在争议。 婴儿痉挛症病因复杂多样，临床报道有关病因多达200余种，其发病机制及药物治疗机制至今尚未明确。目前研究较深入的假说认为婴儿痉挛症的许多种病因与婴儿期未成熟大脑的损伤和应激有关，这种年龄特异性和病因多样性提示婴儿痉挛症发病可能具有共同的应激-兴奋通路：婴儿痉挛症的潜在病因使脑内应激系统过度激活，导致内源性CRH过度表达，可增加未成熟脑神经元的兴奋性，引起严重癫痫发作。CRH为年龄特异性的强致痫剂，机体受到应激后，大脑的杏仁核区、下丘脑、海马等可迅速表达CRH基因，使CRH释放增加， CRH激活突触后的CRH受体后，较少量的谷氨酸信号即可被放大为强大的兴奋性信号，产生癫痫放电，引起癫痫发作。而NMDA受体是兴奋性氨基酸谷氨酸的离子型受体，是由2个NR1亚基和2个NR2亚基（NR2A，NR2B，NR2C， NR2D）组成的对Na+，K+和Ca2+可渗透的四聚体配体门控离子通道。在哺乳动物的大脑中，介导兴奋性神经传递，其功能性质依赖于其亚基的组成，其中NR2亚基控制通道动力学和突触信号。Mares等于1992年首次发现腹腔注射NMDA可诱导婴儿期大鼠产生屈曲痉挛发作，症状类似IS患儿；近年来研究发现编码NR2A、NR2B的GRIN2A、GRIN2B基因发生的功能增益性突变，与IS发病有关。ACTH可通过促进肾上腺糖皮质激素释放，负反馈抑制下丘脑 CRH的产生，或直接作用于中枢，激活黑皮质素受体，降低边缘系统CRH表达而发挥抗惊厥作用。而甲泼尼龙为 ACTH的下游激素，可负反馈抑制中枢神经系统CRH的释放；在成年大鼠癫痫模型的研究中发现，地塞米松可通过下调NMDA受体的NR2A/NR2B亚基的表达发挥抗癫痫作用。 因此，本研究通过制备婴儿痉挛症大鼠模型并给予ACTH及甲泼尼龙治疗，观察两者在IS大鼠模型中的抗痉挛作用及改善认知能力的作用，探讨ACTH及甲泼尼龙在幼年大鼠 IS模型中的疗效，并检测甲泼尼龙用药后大鼠下丘脑中CRH、NR2A、NR2B的变化，初步探讨甲泼尼龙在IS治疗中起效的可能机制。 材料与方法 3月龄健康的SPF级S-D大鼠，雌鼠14只，雄鼠7只，体质量约270-325g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2015-0004。于温度22-24℃，湿度50％-70%，12h:12h光/暗循环（20：00熄灯）环境下饲养，可自由摄取饲料、饮水。1雄2雌自由交配，每日检查雌鼠，出现阴道栓为怀孕，将怀孕雌鼠随机分为产前应激暴露组和非产前应激暴露组，从怀孕第1天起接受相应处理。所产仔鼠由母鼠喂养，将未受产前应激暴露的孕鼠所产仔鼠随机分为空白组（18只），阴性对照组（18只），产前应激暴露组孕鼠所产仔鼠为模型组（110只）。模型组于诱发痉挛发作成功后再次随机分为模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组、脑内应激系统过度激活，导致内源性CRH过度表达，可增加未成熟脑神经元的兴奋性，引起严重癫痫发作。CRH为年龄特异性的强致痫剂，机体受到应激后，大脑的杏仁核区、下丘脑、海马等可迅速表达CRH基因，使CRH释放增加， CRH激活突触后的CRH受体后，较少量的谷氨酸信号即可被放大为强大的兴奋性信号，产生癫痫放电，引起癫痫发作。而NMDA受体是兴奋性氨基酸谷氨酸的离子型受体，是由2个NR1亚基和2个NR2亚基（NR2A，NR2B，NR2C， NR2D）组成的对Na+，K+和Ca2+可渗透的四聚体配体门控离子通道。在哺乳动物的大脑中，介导兴奋性神经传递，其功能性质依赖于其亚基的组成，其中NR2亚基控制通道动力学和突触信号。Mares等于1992年首次发现腹腔注射NMDA可诱导婴儿期大鼠产生屈曲痉挛发作，症状类似IS患儿；近年来研究发现编码NR2A、NR2B的GRIN2A、GRIN2B基因发生的功能增益性突变，与IS发病有关。ACTH可通过促进肾上腺糖皮质激素释放，负反馈抑制下丘脑 CRH的产生，或直接作用于中枢，激活黑皮质素受体，降低边缘系统CRH表达而发挥抗惊厥作用。而甲泼尼龙为 ACTH的下游激素，可负反馈抑制中枢神经系统CRH的释放；在成年大鼠癫痫模型的研究中发现，地塞米松可通过下调NMDA受体的NR2A/NR2B亚基的表达发挥抗癫痫作用。 因此，本研究通过制备婴儿痉挛症大鼠模型并给予ACTH及甲泼尼龙治疗，观察两者在IS大鼠模型中的抗痉挛作用及改善认知能力的作用，探讨ACTH及甲泼尼龙在幼年大鼠 IS模型中的疗效，并检测甲泼尼龙用药后大鼠下丘脑中CRH、NR2A、NR2B的变化，初步探讨甲泼尼龙在IS治疗中起效的可能机制。 材料与方法 3月龄健康的SPF级S-D大鼠，雌鼠14只，雄鼠7只，体质量约270-325g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2015-0004。于温度22-24℃，湿度50％-70%，12h:12h光/暗循环（20：00熄灯）环境下饲养，可自由摄取饲料、饮水。1雄2雌自由交配，每日检查雌鼠，出现阴道栓为怀孕，将怀孕雌鼠随机分为产前应激暴露组和非产前应激暴露组，从怀孕第1天起接受相应处理。所产仔鼠由母鼠喂养，将未受产前应激暴露的孕鼠所产仔鼠随机分为空白组（18只），阴性对照组（18只），产前应激暴露组孕鼠所产仔鼠为模型组（110只）。模型组于诱发痉挛发作成功后再次随机分为模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组、模型Ⅳ组和模型Ⅴ组。 建模综合参考Velí?ek、邹丽萍等报道的产前应激暴露加NMDA腹腔注射法。 1）产前应激暴露：自雌鼠怀孕第1天（以出现阴道栓判断）至分娩前，每日1次（17:00）强制在4℃水中浸泡5分钟，水深为35cm。 2）诱发癫痫：仔鼠出生当日记为P0，于10天龄（P10，10：00），模型组大鼠腹腔注射 NMDA（5mg/kg）诱发癫痫，阴性对照组给予等量生理盐水腹腔注射，空白组不予处理。观察120min，模型组大鼠剔除死亡6只、无发作4只、有发作但无屈曲痉挛者3只，建模成功且存活97只，按随机数字表法选取90只，随机分为5个亚组，另7只弃置。 3）药物预处理：于第10至13天龄（P10-P13）进行。模型Ⅰ组：皮下注射ACTH（50IU/kg，于P10：14:00，21:00；P11、P12：7:00，14:00，21:00，P13：7:00各一次)； 模型Ⅱ组：于相同时间皮下注射与ACTH等量的生理盐水； 模型Ⅲ组：腹腔注射甲泼尼龙(60mg/kg，P11、P12、P13：9:00，每日一次)； 模型Ⅳ组：于相同时间腹腔注射与甲泼尼龙等量的生理盐水； 模型Ⅴ组：阳性对照组，P10-P13间不予任何处理。 4）再次诱发发作：模型组于P13（10:00）腹腔注射NMDA（12mg/kg），阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水，空白组不予处理。 于13天龄诱发癫痫后，进行行为学观察，相应组随机取12只于观察后断头取脑分别进行PCR、免疫组化检测，其余6只于28天龄时进行Y-迷宫实验评价甲泼尼龙与ACTH的疗效。 结果 1行为学观察 P10-P13用药（或盐水）期间各组大鼠无自发性抽搐或死亡。P13诱发发作后模型组大鼠均无死亡。 1.1癫痫发作率 其中模型Ⅰ组有13只发作（72.22%），模型Ⅲ组有14只发作（78.78%），模型Ⅱ组、模型Ⅳ组、模型Ⅴ组大鼠均完全发作，发作率均为100%。但模型Ⅰ组及模型Ⅲ组比较发作率无统计学差异（P＞0.05）。 1.2癫痫发作潜伏期及癫痫评分 模型Ⅰ组及模型Ⅲ组发作程度均明显减轻，未再出现抱团表现，且较模型Ⅱ组、模型Ⅳ组、模型Ⅴ组发作潜伏期延长，发作评分减低，两组间发作潜伏期及发作评分差异均无统计学意义（P＞0.005）。模型Ⅱ组、模型Ⅳ组、模型Ⅴ组均有抱团表现。空白组及阴性对照组大鼠无癫痫发作或死亡。 2 Y-迷宫实验 2.1学习能力测试 各模型组大鼠达到学会标准所需的训练次数与空白组及阴性对照组比较均无统计学差异（P＞0.0024）。 2.2记忆能力测试 24h后的记忆能力测试中，各模型组正确反应率均比空白组、阴性对照组降低（P＜0.0024）；而模型Ⅰ组及模型Ⅲ组与模型Ⅱ组、模型Ⅳ组、模型Ⅴ组比较，正确反应率均无统计学差异（P＞0.0024）。 35组大鼠脑组织病理改变 普通光学显微镜下（×400）观察大鼠下丘脑区发现：空白组及阴性对照组细胞排列规整，形状饱满，形态清晰，结构完整，模型Ⅲ组大鼠下丘脑区细胞层次清楚，可见部分肿胀、变形细胞，模型Ⅳ组、模型Ⅴ组细胞数量稍减少，细胞肿胀，部分胞核可见固缩、碎裂。 4甲泼尼龙预处理对大鼠下丘脑CRH表达的影响 免疫组织化学方法检测：各模型组下丘脑中CRH阳性细胞数均较空白组及阴性对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.005）；模型Ⅲ组下丘脑中CRH阳性细胞数较模型Ⅳ组及模型Ⅴ组明显较少，差异有统计学意义（P＜0.005）。 荧光定量PCR检测：各模型组下丘脑中CRHmRNA的相对表达量均较空白组及阴性对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.005）；而模型Ⅲ组下丘脑中CRHmRNA的相对表达量较模型Ⅳ组及模型Ⅴ组明显较少，差异有统计学意义（P＜0.005）,与免疫组化中CRH阳性细胞的表达水平变化结果一致。 5甲泼尼龙预处理对大鼠下丘脑NR2A表达的影响 免疫组织化学染色显示：模型组大鼠下丘脑中 NR2A阳性细胞数均较空白组及阴性对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.005）；模型Ⅲ组分别与模型Ⅳ组及模型Ⅴ组比较，下丘脑中NR2A阳性细胞数差异无统计学意义（P＞0.005）。 6甲泼尼龙预处理对大鼠下丘脑NR2B表达的影响 免疫组织化学染色结果显示：各模型组下丘脑中 NR2B阳性细胞数均较空白组及阴性对照组增多，差异有统计学意义（P＜0.005）；模型Ⅲ组下丘脑中NR2B阳性细胞数较模型Ⅳ组及模型Ⅴ组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.005）。 结论 甲泼尼龙及 ACTH在婴儿痉挛症大鼠模型中抗痉挛效果无明显差异，或许可成为ACTH药源短缺时的理想替代药物；其治疗机制可能与减少下丘脑CRH、NR2B的过度表达有关。