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猪链球菌(Streptococcus suis)能引起猪脑膜炎、关节炎、败血症甚至死亡,人类感染该茵亦可导致发病,是一种重要的人畜共患病病原体。猪链球菌分35个血清型,其中2型分布最广,致病性亦最强。国内1991年在广东省首次分离到SS2,随后于1998年和2005年分别在江苏和四川部分地区爆发SS2感染,危害严重。目前链球菌2型的致病机理尚未完全清楚。本实验采用抑制性差减杂交的方法对2型毒力菌株所携带的差异基因序列进行了研究,发现了30个可能的毒力基因,并检测了这些基因在其他血清型链球菌中的分布。1抑制性差减杂交为了获得SS2新毒力基因,将SS2毒力菌株HA9801与无毒力菌株T15进行抑制性差减杂交。提取两株细菌基因组DNA,Rsal酶切回收。酶切的HA9801基因组分别连接两个不同的接头。经过两轮杂交后,PCR扩增HA9801特有基因序列。扩增产物连接T载体转化大肠杆菌。随机挑取420个转化克隆,PCR分析其中408个为阳性克隆。2可能毒力基因的筛选、鉴定408个为阳性克隆的PCR产物变性固定于尼龙膜,分别与地高辛标记的HA9801及T15酶切基因组DNA杂交。获得了30个毒力菌株HA9801特异的基因片段。经过比对分析,表明这些片段编码了28种蛋白,如溶血素Ⅲ相关膜蛋白、Ⅳ分泌系统VirB4成分、zeta毒素、DNA重组酶、转运子、信使调节子及氨基酸透性酶等。参照98HAH33菌株全基因组序列,将这些片段进行基因组定位分析,以了解它们在基因组上的分布。3可能毒力基因片段的分布分析根据猪链球菌2型人源98HAH33菌株全基因序列,选择14个具有代表性的差减片段设计引物,PCR检测这些片段在其他链球菌上的分布。结果表明,在SS2菌株中,除了无毒株T15全部阴性,其它不同地区不同年份均有不同程度分布,11株人源分离株全部呈阳性。其它链球菌中,马链球菌兽疫亚种多为阴性,SS1、SS7和SS9各有其分布特点。4猪链球菌2型Ⅳ分泌系统VirB4蛋白及DNA重组酶的表达根据已发表的猪链球菌2型人源98HAH33株的Ⅳ分泌系统VirB4成分和DNA重组酶的基因序列,分析选择免疫原性较高部分的基因序列设计和合成两对引物,并以HA9801株的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出这两个蛋白部分基因并定向克隆至表达载体pET-28a(+)中。重组质粒通过PCR鉴定和测序后,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,SDS-PAGE显示两表达产物约30kD,Western blot显示,其与猪源ZY05719株康复血清反应,抗原性良好。