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鱼类细菌性疾病是阻碍水产养殖业发展的主要制约因素。抗生素的频繁使用不仅造成水质污染,而且因药物残留降低了水产品质量。近年来,在许多生物体中发现的抗菌肽具有较强的抗菌活性,与抗生素相比还具有不易产生耐药性、对生物体危害较小等优点,在水产养殖方面成为一个研究的热点。本研究拟以目前我国单品种出口创汇高、经济价值高的养殖品种之一日本鳗鲡为研究对象,从鳗鲡的主要组织器官中提取抗菌肽,为今后鳗鲡细菌性疾病防控提供新的途径。本研究成功的从表皮粘液和脾脏中分离到三个抗菌肽,主要研究成果如下:
1.丙酮和醋酸提取物抗菌活性的比较。本实验采用10％的醋酸和丙酮两种提取液对日本鳗鲡5种组织/器官(体表粘液、鳃、肝脏、脾脏和肾脏)进行了抽提,比较提取物的抗菌活性。5种组织/器官的醋酸提取物比丙酮提取物具有更强的抑菌活性。5种组织/器官的丙酮提取物除了表皮粘液对迟钝爱德华菌、气单胞菌、嗜水气单胞菌以及溶壁微球菌有抑菌作用外,其余基本没有抑菌活性或抑菌活性很小。因此,我们采用醋酸进一步从表皮粘液和脾脏(鱼类重要的免疫器官)中提取抗菌肽。
2.日本鳗鲡表皮粘液抗菌肽的分离纯化。本试验对日本鳗鲡腹腔注射嗜水气单胞菌进行诱导,采集诱导24h后的鳗鲡表皮粘液,采用醋酸抽提,并结合阳离子交换层析和反相高效液相层析从表皮粘液中分离到一个肽。该肽暂时命名为AP—AJM,对嗜水气单胞菌具有明显抑菌作用.通过质谱分析,确定其分子量为6044.28 Da。Edman降解获得其N末端20个氨基酸序列,通过BLAST比较分析同源性,AP—AJM与数据库中已知的蛋白相似度很低,应该是一种新发现的抗菌肽。
3.比较研究pH缓冲液对脾脏抗菌肽的分离效果和抗菌活性的检测方法。对小于10 kDa样品,探讨了三种pH值缓冲液(0.03 mol/L柠檬酸钠,pH3；0.1mol/L乙酸钠,pH4:0.1mol/L乙酸钠,pH5))对离子交换层析洗脱峰提取得率的影响,结果显示pH4缓冲液用于离子交换层析获得最高洗脱峰提取得率。对小于10kDa样品离子交换洗脱峰,比较了四种pH值缓冲液(0.1％.TFA/2％乙腈,pH2；0.01 mol/L磷酸氢钾/2％乙腈,pH7；0.01 mol/L Tris—C1/2％乙腈,pH9；0.01 mol/L NaOH/2％乙腈,pH12)进行反相高效液相色谱分离抗菌肽的效果。结果显示pH9缓冲液明显改善了分离效果,表现在获得的洗脱峰数量是其他三种缓冲液的两倍,峰更尖锐,pH2缓冲液的分离效果次之。对小于10 kDa样品,比较了琼脂板孔穴扩散法、微孔液体培养和微量液体培养法三种方法用于抗菌肽活性检测的灵敏度。结果显示琼脂板孔穴扩散法适合抗菌肽粗提物的活性检测,微量液体培养法具有较高的灵敏度且样品用量少,适合离子交换层析和反相高效液相层析洗脱峰的活性检测。
4.日本鳗鲡脾脏抗菌肽的分离纯化。我们选择pH4缓冲液对日本鳗鲡小于10kDa和小于3kDa两部分样品分别进行阳离子交换层析分离,对洗脱峰脱盐处理,并进行抗菌活性检测。结果显示小于10kDa样品离子交换层析洗脱峰对105cfu/mLB09、B18和B27有很强的抑菌活性。小于3kDa样品离子交换层析洗脱峰对104cfu/mL B09基本没有抑菌作用,对B18和B27有较强的抑菌活性。
根据之前的实验结果,我们对小于10 kDa样品离子交换层析洗脱峰进一步采用pH9缓冲液分离纯化,获得一个抗菌肽,质谱分析其分子量为1391.82 Da；采用pH9和pH2两种缓冲液对小于3kDa样品离子交换层析洗脱峰进一步分离纯化,获得一个抗菌肽,质谱分析其分子量为839.19 Da。