论文部分内容阅读
目前，血液病与心血管疾病已是危害人类健康的重大问题，给国民经济带来不可估量的损失。我国至少有400万白血病患者，每年新增约4万名白血病患者，其中50％是儿童。心血管病患者人数约为2.3亿，相当于每10个成年人中有2人患有心血管疾病。因此，揭示造血及心血管发育的分子机制及其相关疾病的发病的机理，建立新的防治策略和治疗方案是医学和生命科学领域急需解决的重大基础科学问题。目前，研究者面临的最大挑战就是寻找更多造血及心血管发育具有调控功能的治疗靶分子和信号途径。 MicroRNA(miRNA)是近年发现的一类内源的、长度约22个核苷酸的非编码微小RNA，广泛存在于真核生物中，具有多种重要的调节作用。miR-144是在造血组织及血液中特异表达的一个miRNA，已报道miR-144在白血病患者表达显著降低，并且在肿瘤发生、血红蛋白合成中发挥重要作用。但miR-144在造血与血管发育中的功能作用仍不清楚。本研究以模式生物斑马鱼为研究对象，采用生物信息学预测分析方法、显微注射、整体原位杂交以及拯救实验技术，揭示miR-144在斑马鱼胚胎造血及血管发育过程的生物学功能，阐明miR-144介导的血细胞发育及血管发育的分子机制。首先，应用多个在线生物信息学软件全面预测分析miR-144靶向调控潜在靶标，发现包括meis1在内的三十多个基因可能是miR-144的潜在靶标。通过体内外报告基因质粒检测发现miR-144直接靶向调控meis1表达。进一步通过显微注射在斑马鱼胚胎过表达miR-144，发现斑马鱼胚胎MEIS1表达显著降低。从而说明在斑马鱼胚胎中miR-144通过直接靶向调控meis1表达(P<0.05)。Meis1是三氨基酸环延伸家族一员，是同源基因hoxa9和pbx1的辅助因子。已有大量研究表明meis1对内皮细胞分化、造血、眼睛发育等有举足轻重的作用，并且与白血病发生相关。接下来深入探究miR-144介导meis1表达在斑马鱼胚胎造血及血管发育中的功能作用。 其次，应用细胞化学染色检测发现过表达miR-144阻滞胚胎中包括粒细胞、巨噬细胞在内髓系细胞的发育。经整体原位杂交检测发现，髓系血细胞发育的关键基因(scl、gata2和pu.1)和造血干细胞标记基因(c-myb,runx1)表达降低。紧接着通过显微共注射meis1基因mRNA的拯救实验发现回补meis1可明显恢复scl、pu.1、c-myb和runx1基因表达，同时回补了胚胎粒细胞、巨噬细胞的生成。从此说明miR-144介导meis1表达调控斑马鱼胚胎髓细胞发育。 第三，经O染色检测发现过表达miR-144显著降低胚胎红细胞生成，同时经原位杂交检测发现红细胞发育相关基因scl、gata1、cmyb以及runx1在高表达miR-144的胚胎中表达式显著降低，但通过拯救实验发现用meis1基因mRNA不能很好恢复胚胎红细胞生成，而是采用meis1基因和gata1基因mRNA共同注射才能恢复胚胎红细胞生成。综合相关文献，推测miR-144/451基因簇协调表达调控胚胎红细胞发育。 最后，应用转基因斑马鱼(flk1)研究发现高表达miR-144显著影响胚胎内皮系统发育，胚胎节间血管(ISV)生成严重受阻，且在DA区荧光强度也有所降低。进一步经原位杂交检测发现高表达miR-144显著降低动脉标记基因(ephrinB2)表达，而静脉发育标记基因(flt4、ephB4)未见明显变化。通过拯救实验发现meis1基因mRNA可以恢复胚胎节间血管(ISV)和动脉发育。从而说明miR-144介导meis1表达在斑马鱼胚胎血管发育中有着重要的生物学功能。本研究的完成丰富了脊椎动物造血及血管发育过程的分子调控信号通路，将为相关的血液病的预防、临床治疗等提供新的分子靶点和研究思路。