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神经系统是机体最重要和最复杂的系统,起源于神经管(neuarl tube)和神经峭,神经管形成中枢神经系统(central nevrous system, CNS)(脑和脊髓),神经峭形成周围神经系统的神经节等。CNS正常发生的关键是神经板内外相关组织细胞行为的准确进行和协同,神经管的形成是该过程结束的标志。神经管发生是一个重要的涉及到建立中枢神经系统原基的胚胎学事件,是指从神经板出现到神经管关闭的发育过程。神经管管壁最初是由一层较厚的假复层上皮组成,称为神经上皮(neuroepithelium)。神经上皮不断增殖的同时细胞也逐渐开始进行迁移和分化,逐渐形成三层结构的管壁,由内向外依次为室管膜层,套层和边缘层。在此过程中,神经上皮细胞处于活跃的细胞增殖周期中,为具有多种分化潜能的神经干细胞(neutal stem cell, NSC),伴随着分化演变。神经上皮中神经干细胞的增殖迁移以及分化是神经系统发育的关键环节。研究发现神经管形成时期极易受多种内外因素的干扰而致畸,神经管缺陷(neural tube defects, NTDs)就是其中发病率最高的一种,表现为各种脑和脊髓的发育畸形。多年来的研究提示NTDs的发生与神经上皮的异常发育密切相关。从基因水平而言,神经上皮的发育过程是一系列基因按照高度特异的时空模式表达并相互作用的结果,但迄今对此复杂过程的基因表达与调控的了解还很少。在各种调控机制中,Notch信号通路(Notch signaling pathway)与神经管的发育有着密切关系,并且由它介导的“旁侧抑制(lateral inhibition)”机制被认为是决定NSC分化命运的一个关键环节。反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是维生素A在体内的正常代谢产物,它是一种作用很强的诱导分化剂,在神经管的形成过程中,它具有很重要的作用。由维甲酸诱导形成的NTDs模型在科学研究中已经得到了广泛的应用,但其具体的致畸作用机制尚未见文献报道。鉴于NSC增殖与分化的机制在神经管形成时期具有重要意义,所以本课题利用Western blot、Real-time PCR、双荧光素酶报告基因系统、神经干细胞体外培养、质粒转染及免疫荧光染色等技术,初步研究了ATRA对NSC分化过程中Notch信号通路的具体调节途径,为进一步探讨Notch信号通路在胚胎神经系统发育中的作用机制,尤其是对神经上皮细胞的增殖分化的影响以及在神经管发育和NTDs中可能分子机制奠定了理论基础和实验依据。第一章神经干细胞分化过程中Notch信号通路相关基因的表达变化目的探讨神经干细胞体外分离培养的方法、增殖特点和多向分化的特性。使用ATRA作用于处于分化状态的NSCs,检测其对Notch信号通路相关基因(Notch 1, Musashi 1, Numb, Presenilin 1, Rbpj, Hes 1, Sox 1, Mash 1和Neurogenin 2)表达变化的影响。方法取15天C57BL/6胎鼠的大脑皮质组织,采用机械分离的方法获得神经干细胞,并应用无血清神经干细胞培养基进行原代和传代培养。对培养的神经干细胞进行Nestin(巢蛋白)免疫细胞化学鉴定;将获得的神经干细胞进行体外分化,对分化结果进行NF(Neurofilament,神经丝蛋白,为神经元标志抗原)、GFAP(Glial Fibrillary Acidic protein,胶质原纤维酸性蛋白,为星形胶质细胞标志抗原)和GALC(Galactocerebroside,半乳糖脑苷脂,为少突胶质细胞标志抗原)免疫细胞化学鉴定。并在神经干细胞增殖和分化过程中进行细胞形态学观察。将第5代经鉴定过的神经干细胞分为两组:对照组使用分化培养基进行培养,实验组就是在对照组的基础上再同时加入1μmol/L ATRA。每组分别取NSC(分化0d),分化1,3,5,7d共5个时间点进行实验,每个时间点分别重复三次。在各个时间点通过实时荧光定量PCR反应检测Notch通路相关基因在mRNA表达水平的相对变化情况,通过Western Blot测定Notch1蛋白胞内段NICD的相对表达变化。结果采用机械分离和无血清培养的方法可以获得大量的神经干细胞,对其进行Nestin免疫细胞化学鉴定为阳性,证明为神经干细胞;神经干细胞体外分化可获得各种神经终末细胞,NF、GFAP和GALC鉴定结果均为阳性,证明可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。使用ATRA后,Notch 1表达降低,其胞内段NICD的生成量也降低,Musashi 1表达增高,Numb表达先增高后降低,Presenilin 1表达增高,Rbpj表达先降低后增高,Hes 1表达降低,Sox 1表达降低,Mash 1表达降低,Neurogenin 2表达降低。结论应用机械分离和无血清神经干细胞培养基培养的方法可获得大量的神经干细胞,这些神经干细胞具有多向分化的潜能,可分化为神经元等多种神经终末细胞。Notch 1、Hes 1表达的降低和NICD生成量的降低说明ATRA可能直接或间接地通过抑制Notch 1的表达从而促进了神经干细胞的分化,Musashi 1表达增高以及Numb在后期表达相应的降低可能与Notch 1胞内段NICD减少从而产生一种反馈性调节机制有关,Presenilin 1表达增高以及Rbpj表达在后期的增高也可能属于这种反馈调节机制。Sox 1表达的降低可能并不是因为ATRA的作用引起的,而是因为Hes 1表达降低产生反馈调节引起的。Mash 1和Neurogenin 2表达降低说明,使用ATRA后NSC向神经元方向的分化减少了。第二章γ-分泌酶在神经干细胞分化过程中的作用目的建立基于Gal4-VP16/UAS系统和双荧光素酶报告基因系统检测神经干细胞分化过程中γ分泌酶活性的方法。对神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性、酶解产物NICD和活性中心—早老素1(Presenilin 1, PS1)进行检测,为后期深入研究神经干细胞分化过程的调节机制提供一个重要的实验基础。检测神经干细胞分化过程中ATRA对γ分泌酶活性的影响。方法将编码携带有转录激活因子Gal4-VP16的小鼠Notch1跨膜与胞内段的质粒Notch1△E-GVP,编码萤火虫荧光素酶基因和上游激活序列(UAS)的质粒MH100,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入处于分化状态的神经干细胞,利用Gal4-VP16/UAS系统和双荧光素酶报告基因系统测定神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性;通过Western blot技术检测γ分泌酶酶解产物NICD的生成量;采用实时荧光定量PCR测定γ分泌酶活性中心PS1的表达。结果在γ分泌酶抑制剂DAPT作用下,γ分泌酶活性呈剂量依赖性降低,NICD的生成量也同步减少,而其催化中心组份PS1的表达则呈反馈性的同步增高。使用ATRA作用于处于分化状态的NSCs后,γ分泌酶的活性增高了。结论利用Gal4-VP16/UAS系统和双荧光素酶报告基因系统来检测神经干细胞分化过程中γ分泌酶的活性,为研究神经干细胞分化过程的调节提供了一个重要的实验方法。在神经干细胞分化过程中,从γ分泌酶对Notch通路的这个调控范围来说,ATRA抑制Notch通路的作用在于抑制Notch 1的表达,而不在于直接抑制γ分泌酶的活性及其催化组份早老素1的表达。