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高尔基堆叠蛋白GRASP65(Golgi ReAssembly Stacking Protein of65 kDa)和高尔基基质蛋白GM130都是高尔基体行使正常功能不可或缺的蛋白，它们在细胞分裂期高尔基体囊膜发生堆叠、解聚和重堆积的过程中发挥了决定性作用，并且在囊泡栓链的形成以及高尔基体之间带状结构的形成方面也都起到了非常关键的作用。GM130通过C端与GRASP65蛋白相互作用而被锚定在高尔基体顺面膜上，一般是通过形成蛋白复合物的形式共同行使生理功能。但是对于两者之间相互作用的结构基础和分子机理一直都没有详细的研究和报道。 本研究利用X射线晶体学技术，成功获得了GRASP65 PDZ结构域与GM130 C端多肽（记为GM130peptide）相互作用的蛋白复合物晶体，并解析该复合物结构，分辨率高达1.96(A)。基于结构上新的发现，综合运用了定点突变和生物化学方法深入研究两者结合的分子机理，并对其在高尔基体上的功能机制进行了推测。 1、对比GRASP65单体的结构，结合了GM130peptide后的GRASP65结构发生巨大的变化:PDZ2结构域相对于PDZ1结构域旋转了32.6°; PDZ1与PDZ2结构域之间形成的相对角度由74.7°张开到105.9°;这样的一个变化会使PDZ1和PDZ2中之间有更多的空间去容纳GM130peptide蛋白。GM130peptide与PDZ1上的多肽结合位点结合，使相邻的GRASP65分子的GRASP结构域末端不能与此位点结合，从而呈现出一种无序的状态。 2、前期的研究指出，GM130与GRASP65相互作用主要是结合GRASP65的PDZ2结构域，而对应的GM130结合位点是最末端的几个氨基酸。而从本研究的复合体晶体结构上来看，GRASP65的两个PDZ结构域都参与了与GM130的结合:一个是PDZ1结构域以PDZ经典多肽结合方式与GM130的C末端形成稳定的结合;另一个是GM130peptide中的5个氨基酸共同形成了一个疏水区域，插入到了GRASP65蛋白中PDZ1和PDZ2连接处形成的“疏水口袋”内。另外，我们也在GRASP65蛋白的结构上找到了参与两者相互作用的重要氨基酸:His18&His20、Arg101、Lys162。 3、为了验证我们从结构上发现的关键氨基酸，我们设计了二者相互作用中关键氨基酸的突变体蛋白，利用等温滴定量热法(ITC)测定野生型蛋白和突变体蛋白两两交叉配对的每组蛋白之间的解离常数(dissociation constant，Kd)，通过分析比较每组蛋白相互作用的强度来确定这几个氨基酸的重要性。结果显示:突变了GRASP65蛋白中的Gly97氨基酸(G97D)后完全无法与野生型 GM130peptide相互结合;突变了GM130peptide的Phe975(F975A)或Ile990(I990R)也都无法与野生型GRASP65蛋白相互作用;GRASP65蛋白His18&His20、Arg101和Lys162突变后（分别是H18A&H20A、R101A和K162A）与野生型GM130peptide的结合力有不同程度的下降。 4、为了验证这些氨基酸在体内的重要作用，我们利用GM130会募集Hela细胞的内源GRASP65使线粒体产生聚集的现象，通过共聚焦荧光显微镜观察到聚集情况判断氨基酸的功能。我们比较转染了野生型和突变型GM130peptide后的Hela细胞线粒体的聚集情况，结果显示，Phe975或Ile990突变后的GM130peptide明显观察不到线粒体的聚集，说明在细胞体内这两个氨基酸确实是与GRASP65蛋白相互作用的关键。 5、从复合物晶体结构分子排列上可以看到GRASP65结合了GM130peptide后形成周期为六个分子的超螺旋结构，一个螺旋中的六个GRASP65分子如果固定在一个平面上就会形成一个六聚体环。而生理状态下GRASP65的N端第二个被豆蔻酰化甘氨酸位于同一侧并且固定在高尔基体囊膜上。在这个基础上，我们提出了关于GRASP65调控高尔基体堆叠的分子模型:在两个顺面囊膜之间GRASP65/GM130/p115形成的三元复合物调控高尔基体顺面囊膜的堆叠，称此为“双轮”模型;在顺面囊膜与囊泡之间GRASP65/GM130/p115/giantin共同调控了囊泡的栓链形成，一端是GRASP65锚定在高尔基体顺面囊膜上，另一端是p115与giantin相互作用而使其描定在顺面囊膜上，称此为“单轮”模型。