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龙须草(Eulaliopsis binata)属于禾本科黍亚科拟金茅属,是无融合生殖比例在95％以上的兼性无融合生殖植物。龙须草的无孢子生殖起始细胞经有丝分裂形成大黍型4细胞成熟胚囊,胚和胚乳无需受精即可自主发生,产生的种子具有与母本一致的基因型,是可用于固定作物杂种优势的良好植物资源。在无融合生殖为主的物种中寻找有性生殖材料,是研究其无融合生殖遗传调控机制的基础。因此,本研究采用细胞组织化学以及胚胎学研究方法,观察不同居群龙须草胚囊发育模式,寻找龙须草有性生殖居群或单株,为进一步研究龙须草无融合生殖遗传规律、分离其无融合生殖相关基因奠定基础。
有研究表明,拟南芥的FIS类基因突变后导致中央细胞不受精即可自主分裂,产生类似于无融合生殖植物胚乳自主发生的表型。因此,研究胚乳自主发生型无融合生殖植物龙须草FIS类基因的功能,将有助于理解有性生殖与无融合生殖植物胚乳早期发育的机理。本研究利用课题组已分离得到的3个龙须草FIS类同源基因,采用原位杂交方法,分析FIS类基因在龙须草生长发育过程中的时空表达,为研究龙须草FIS类基因的功能提供依据。
主要研究结果如下:
1.龙须草胚珠发育早期胚囊起始细胞胼胝质的沉积
有性生殖胚囊的起始细胞即大孢子母细胞的细胞壁上通常有胼胝质沉积。因此,本研究通过石蜡切片结合脱色苯胺蓝染色,根据龙须草发育早期的胚珠中是否有胼胝质荧光,判断胚珠中有性生殖胚囊的起始,同时也鉴别龙须草无孢子生殖起始细胞是否有胼胝质荧光积累。结果表明,在供试的4个龙须草居群发育早期的珠心组织中均观察到高比例的胼胝质荧光(星子为86.81％,衡阳95.05％,西峡96.77％,淅川92.71％),表明龙须草胚囊发育早期存在很高比例的有性生殖起始。胼胝质首先在这些有性胚囊起始细胞的细胞壁上积累,随着胚囊母细胞减数分裂的进行,在大孢子四分体的细胞壁上也有胼胝质沉积。减数分裂结束后,胼胝质在珠孔端的分布多于合点端,直到功能大孢子选择时期胼胝质壁才开始降解,符合有性生殖蓼型胚囊发育过程中胼胝质的分布模式。有性胚囊减数分裂前、后期,在珠心近合点区域出现1-多个膨大的无孢子生殖胚囊起始细胞,在这些细胞的细胞壁上则未见胼胝质荧光,表明龙须草无孢子生殖起始细胞无胼胝质积累。
2.龙须草有性生殖与无融合生殖胚囊发育模式
2.1无孢子生殖胚囊发育过程及起始时期
四个龙须草居群的细胞学研究表明,大孢子母细胞时期或四分体时期,毗邻有性细胞的合点端珠心细胞可特化为无孢子生殖起始细胞,并直接发育为单核胚囊。随后其核经两次有丝分裂形成具4核的无孢子胚囊,4个核进一步分化形成一个卵细胞,一个助细胞,两个极核或一个卵细胞,两个助细胞,一个极核的大黍型胚囊。
2.2有性胚囊发育过程及比例
在星子、衡阳和西峡居群的胚囊发育过程中,观察到大孢子母细胞的形成,规则的减数分裂过程以及线型排列的大孢子四分体,功能大孢子经过三次有丝分裂形成典型的含7细胞8核的有性生殖蓼型胚囊。有性生殖成熟胚囊的发生比率为1～2％,且不同居群间有差异。
在胚囊发育过程中,未见有性生殖的蓼型胚囊与无孢子生殖胚囊同时发育成熟,说明有性生殖和无融合生殖存在竞争,无孢子生殖胚囊的发育占优势,导致多数有性生殖胚囊在发育过程中败育。
3.FIS类基因的时空表达
以龙须草FIS类基因FIE,EMF1,EMF2的mRNA为探针,分别检测龙须草成熟区根、叶片、幼嫩和成熟期花药、成熟胚囊、不同发育阶段的胚和胚乳等器官和组织中这3个基因的时空表达,结果如下:
3.1 FIE基因的表达模式
FIE基因在龙须草成熟区根的表皮细胞、皮层薄壁细胞和维管组织的韧皮部可检测到杂交信号,在叶中的表达则集中于近下表皮的韧皮部。FIE基因在小孢子母细胞、绒毡层和药隔维管束中的表达较强,但随着雄配子体的发育,FIE基因在单核花粉时期的花药中表达下降；在成熟胚囊里有少量表达。FIE基因在受精后不同发育阶段的胚和胚乳中有较强表达,在胚胎发育后期杂交信号更强,而且在胚乳中的表达强于胚胎。龙须草FIE基因在营养器官和生殖器官的组成型表达,表明其可能参与龙须草生长发育的多个过程,其在胚和胚乳中的较强表达,显示FIE基因的功能与胚和胚乳发育有关。
3.2 EMF1基因的表达模式
EMF1基因在龙须草的各组织部位均检测到杂交信号,在球型胚和梨形胚时期的子房中表达强烈；EMF1基因在雄配子体中的表达模式与FIE基因相似,即在花粉母细胞时期的绒毡层、小孢子母细胞和药隔中有较高的表达,单核花粉时期表达下降；在营养器官的根中杂交信号很强,主要表达部位是根表皮细胞和韧皮部；在叶中的表达则集中在近下表皮的韧皮部和维管束内。EMF1基因的表达模式表明,其在龙须草营养生长和生殖生长中可能具有一定功能。
3.3 EMF2基因的表达模式
EMF2基因在龙须草生殖器官中有较高的表达,尤其是在受精后5天的胚和胚乳中表达量达到最高；EMF2基因在雄蕊中的表达模式与EMF1相似,随小孢子发育其表达下降；但是在营养器官的根和叶中,其表达量要低于EM目的表达,只在根表皮细胞中有较淡的颜色,说明EMF2基因可能主要参与龙须草胚和胚乳发育的调控。